实验8酶的分离纯化课件.ppt
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1、酶的概念:,酶是生物催化剂,是活细胞合成的具有高度催化效率和高度特异性的一类蛋白质。,知识回顾,酶促反应的特点 它遵守一般催化剂的共同性质:1.在化学反应前后都没有质和量的改变;2.只能促进热力学上允许进行的反应;3.只能加速可逆反应的速率,而不能改变反应的平衡点,即不改变反应的平衡常数。4.酶和一般催化剂都是通过降低反应活化能而使反应速 率加快。,酶不同于一般催化剂的特点:(一)酶的催化效率极高 通常比非催化反应高1081012倍;比一般催化剂高 1071013倍。,过氧化氢分解反应所需活化能,(二)酶具有高度特异性 1绝对特异性:有的酶只能作用于特定结构的底物,进行一种专一的反应生成特定结
2、构的产物,称之为绝对特异性(absolute specificity)。2相对特异性:大多数酶作用于一类化合物或一种化学键,这种不太严格的选择性称为相对特异性(relative specificity)。,绝对特异性,相对特异性,图5-9 蔗糖酶的水解作用,3立体异构特异性:一些酶仅能催化一种立体异构体进行反应,或其催化的结果只产生一种立体异构体,酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异性(stereospecificity)。,图5-11 乳酸脱氢酶的立体异构特异性,主要内容,单底物酶处反应动力学 酶的分离纯化,单底物酶促反应动力学,酶动力学是研究酶促反应的速度问题,即研究各种 因素对酶促反应
3、速度的影响。酶动力学理论与实验在生物化学领域,特别在酶学研究中,有十分重要的作用。例如,根据某些因素对酶促反应速度的影响,可推断该酶促反应的机制。又例如,要准确测定酶活力单位,就需要对最佳反应条件及各种因素的影响进行研究。酶促反应有单底物反应和多底物反应之分。单底物酶促反应包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反应。,各种因素对酶反应速度的影响,2、底物浓度3、pH(最适 pH的概念)4、温度(最适温度的概念)5、激活剂6、抑制剂,1、酶浓度,当S足够过量,其它条件固定且无不利因素时,v=kE,第一节 动力学方程推导,酶反应的基本动力学关系,是指酶反应速度与酶和底物间的动力学关系。因为酶和底物
4、是构成酶反应系统最基本的因素,它们决定酶反应的基本性质、酶反应的速度规律,而其他各种因素也正是通过它们产生影响的;而且,这种动力学关系是整个酶反应动力学的基础。描写这种基本动力学关系的是米氏方程(Michaelis-Menten equation)。,v=vmaxS/(Km+S),单分子酶促反应的米氏方程及Km,推导原则:从酶被底物饱和的现象出发,按照“稳态平 衡”假说的设想进行推导。,米氏方程:,米氏常数:,米氏方程的推导,令:,将(4)代入(3),则:,ES生成速度:,,ES分解速度:,即:,则:,由于酶促反应速度由ES决定,即,将(2)代入(1)得:,(3),当酶反应体系处于恒态时:,当
5、Et=ES时,,酶反应速度与底物浓度的关系曲线,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比。,目 录,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速。,目 录,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加,达最大速度。,目 录,第二节 实验数据的处理分析酶促反应速度的作图法,一、Lineweaver-Burk法(双倒数作图法),将实验所得的一些初速度数据v和S取倒数,得各种1/v和1/S,将1/v对1/S作图,得一直线。该直线纵截距1/Vmax,斜率Km/Vmax,横截距-1/Km。应用双倒数作图法处理实验数据求Km和Vmax等动力学常数比较方便,也是最广泛应用的一种方法,但欲要获得较准确的结果,实
6、验时必须注意底物浓度范围,一般所选底物浓度需在Km附近。,1.下图是根据S在0.332.0Km范围时的实验结果而作的双倒数图,从此图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。,S在0.332.0 Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。,2.如果所选底物浓度比Km大得多,则所得双倒数图的直线基本上是水平的。这种情况虽可测得1/Vmax,但由于直线斜率近乎零,-1/Km则难以测得。,S在3.320 Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。,3.如果S比Km小得多,则所作双倒数图的直线与两轴的交点都接近原点,使-1/Km 和1/Vmax,都难以测准。,S在0.033 0.2Km的范围的实验结果而作出的
7、双倒数图。,二、其它线性作图法1.Hanes-Woolf作图法即把米氏方程重排成线性方程,2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法将米氏方程重排为线性方程:,3.Eadie-Scatchard作图法将米氏方程重排为线性方程,以上三种作图法也应注意选择底物浓度,不要使S比Km高得多或低得多。上述几种线性作图法各有其优缺点。双倒数作图法应用最广泛。但此法有两个缺点:第一,在v S图上,由相等增值而给出的等距离各点,在双倒数图上变成非等距离的点,且多数点集中在1/v轴附近,而远离1/v轴的地方只有少数几个点,恰好这些点又正是主观目测以确定直线最权重的那些点。第二,在测定v时产生
8、的小误差,当取倒数时会放大。在低底物浓度下更为敏感,因在高1/S值所得的一两个不准确的点,会给图的斜率带来显著误差。第一个缺点可通过选择适当的S,使1/S为等距离增值而得到克服。对第二个缺点关键要注意在低底物浓度下使所测初速度误差尽可能减小。,S/v对S作图,S未取倒数。另两个线性作图法,v未取倒数。前者对等距离 S增值所测数据作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下测定误差较大时使用,比其它方法更可靠。,三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该法是把S值标在横轴的负半轴上,而把测得的v值标在纵轴上,然后把相应的v和S连成直线,
9、这样所得的一簇直线交于一点,该交点坐标为Km和Vmax。,Lee和Wilson改良双倒数方程对数据的处理改良的双倒数方程形式与双倒数方程相似,为,其中,是t这一段时间内的平均速度;,为反应过程中底物浓度的算术平均值。由于积分方程对任何反应程度的数据处理都是准确的,处理实验数据的准确性如何,,用,可以通过,与,对比:,从以上计算可以看出,用改良的双倒数方程作图法处理实验数据时,即使反应已进行到30,所引入的误差也不过1左右。很明显,如果所有酶是饱和的,而且反应显著不可逆,而且没有产物抑制的情况,用改良双倒数法处理实验数据来测定Km和Vmax,可获得准确结果。如有必要,可用捕获剂或偶联酶使产物不断
10、移去,迫使反应不可逆,并使产物抑制成为最小。,酶促反应速度的测定与酶的活力单位,1、测定酶促反应的速度必需测初速度2、酶活力,3、酶活力的表示方法4、酶活力测定方法:终点法 动力学法,检测酶含量及存在,很难直接用酶的“量”(质量、体积、浓度)来表示,而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量,即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力,酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。,酶活力测定方法,终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应,再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物底物或辅酶的变化量,直接测定出酶反应的初速度。,酶活力的表示方法,
11、活力单位(active unit)习惯单位(U):底物(或产物)变化量/单位时间 国际单位(IU):1moL变化量/分钟 Katal(Kat):1moL变化量/秒,转换系数(Kcat)底物(moL)/秒每个酶分子,比活力(specific activity),第四节 酶的分析和检测,一、酶促反应初速度随Et的变化酶促反应的初速度随Et的变化而变化。通常在离体测定条件下,Et一般为10-12 10-7 mol/L,而St为10-6 10-2mol/L。可将米氏方程转变为以下形式:,这样,当S为常数时,则初速度v与Et成正比。但一个酶促反应速度,常因S的改变而改变。因此反应时间必须尽可能短,使S几
12、乎处于恒态(即只有5以下的底物形成产物),才能得到真正的初速度,v与 Et之间的关系才会是线性的。,二、酶活力单位和比活力 是指酶在一定作用条件下,单位时间内,使底物转化的量或产物生成的量。也就是说,酶量的多少是采用其催化能力来度量;换句话说,是采用酶催化反应的速度来度量,因为在适当的条件下,vE。为了使酶单位的文献报道能统一,并具有可比性,国际酶学会议曾制订了一个标准单位:在特定条件下,1分钟内能转化1微摩尔底物所需的酶量为一个酶单位。所谓特定条件,温度定为25,pH、底物浓度等其它条件均定为最适条件。该酶单位称为国际单位IU)。酶制剂中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。酶的比活力(sp
13、ecific activity)是指每毫克蛋白中所含的酶单位数,用U/mg蛋白表示。,三、酶的转换数转换数可用两种方法表示。其一是以分子活性(molecular activity)来定义,即在最适条件下、每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数(即每微摩尔酶的酶单位数)。其二是许多酶为寡聚体。含几个亚基,因此可用另一种方式来表示转换数,即在最适条件下,每摩尔活性亚基或催化中心每分钟所转变的底物摩尔数。这两个值有时简单以min-1表示,即:,酶的kp值约在50107min-1。碳酸酐酶是己知转换数最高的酶之一(36106min-1)。1/kp=1.7sec,即该酶一个催化周期为1.7微秒。,第五节 酶促
14、反应的稳态前动力学,一、快反应技术酶促反应动力学研究有两条途径:一是稳态动力学。它是监测整个反应,得到关于反应的笼统信息。二是稳态前动力学,它能更直接地研究整个反应中的基本步骤或部分反应,提供可用于分析复杂反应机制的更有效的数据,但需要特殊的仪器来测量快反应。所谓快反应,是相对于普通的混合和观察方法所需要的时间而言。完成总反应量的一半,即所谓反应半时间,为秒或更短时间,则属快反应。采用手工混合启动反应,用普通的分光光度计等仪器所能测量的反应半时间为分和小时。而酶促反应常常是反应半时间短于一秒的快反应,采用普通方法是不行的。限制仪器测定能力的主要因素有:混合样品并充满反应池所需的时间,观察和记录
15、变化所需的,时间。快速反应动力学技术因此应运而生,并得到不断发展。目前,甚至已能测定反应半时间与分子振动和转动所需时间相当的反应。化学反应半时间不可能短于10-11秒,故可认为已没有哪个化学反应是快得无法测定的。流动法和弛豫法,是为研究溶液中快反应动力学而建立起来的方法。前者包括常流法、加速流动法、停流法和淬灭法;后者包括温度、压力、电磁场的跳变或周期性变化法等。由于这些方法采用与停流相似的液体处理系统和相同的快响应探测和数据采集系统,所以常在一台仪器上更换相应的附件实施上述多种测量,构成组合式仪器。,酶的分离纯化,酶分离纯化的目的,酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。,分离纯化
16、过程包括3个基本步骤:1 抽提2 纯化3 制剂,Crude product concentration versus selling price(Dwyer,1984),某些生化物质在原料液中的浓度与价格的关系(1984年),在分离纯化中必须注意:1 防止酶的变性失活;2 在分离纯化过程中的每一步都 应检测酶的活性,以确定酶的 纯化程度和回收率。,第一节 酶活力的测定,几个名词1 酶活力或酶活性2 酶活力单位3 mol催化活性(分子活性)和转换 数(催化中心活力)4 酶的比活力,酶活力(又称酶活性)(enzyme activity)(IU/g或IU/mL)指酶催化一定化学反应的能力;用在一定条
17、件下,所催化的反应初速度来表示;是研究酶的特性,酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。,酶活力单位(enzyme activity unit)表示酶活力大小的尺度;一个国际单位(IU)是指在特定条件下(25 0C),每分钟内转化1mol底物或催化形成1mol产物所需的酶量一个Kat是指每秒钟内转化1mol底物所需的酶量,1 Kat=6107 IU。,mol催化活性(分子活性)和转换数(催化中心活力)mol催化活性是指单位时间内,每个酶分子所转换的底物分子数目;转换数(Kcat)是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如果酶分子中只有一个活性中心,那么mol催化活性与转换数相等
18、,如果酶分子中含有n个活性中心,那么转换数则为mol催化活性除以n。,酶的比活力(specific activity)酶的比活力是酶纯度的量度,是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力,单位为IU/mg。比活力越大,酶纯度越高。,酶活力的测定方法:终止反应法和连续反应法。,终止反应法在恒温反应系统中,每隔一定时间,取出一定体积的反应液,用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止,然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法,几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。,连续反应法无须终止反应,而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反
19、应的进行情况,对记录结果进行分析,然后计算出酶活力。,酶不可逆失活的原因和机理,蛋白质(酶)的失活机理,蛋白质不可逆失活的原因,蛋白酶水解或自溶作用,表面活性剂和去垢剂,聚合作用,氧化作用,机械力,变性剂,重金属离子和巯基试剂,冷冻和脱水,热,极端pH,蛋白质不可逆失活,脲和胍,高浓度盐,螯合,有机溶剂,辐射作用,蛋白质的稳定化,蛋白质稳定化,蛋白质稳定化途径,如何防止蛋白质的可逆伸展,如何防止蛋白质不可逆失活反应发生,稳定蛋白质(酶)的方法,酶分离的一般流程,第二节 酶溶液的制备,酶溶液的制备:把酶从生物原料中抽提出来,作成酶溶液 酶溶液的制备包括:材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体
20、液的浓缩等几个步骤。,一、材料预处理及细胞破碎材料预处理:酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况:胞外酶,胞内酶(溶酶和晶酶)。,微生物胞外酶 可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶 要先收集菌体,经细胞破碎后提取,动物材料 应先剔除结缔组织和脂肪组织等植物材料 应去皮等以免单宁等物质着色污染,细胞破碎:物理和化学两大类方法,1、物理破碎:研磨(手磨,球磨和石磨),机械捣碎(匀浆器和高速组织捣碎器等),高压法,爆破性减压法,专用波振荡,快速冷冻融化法等。,2、化学破碎:渗透作用 自溶:酶处理 表面活性剂,(I)渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净,并悬浮于含蔗糖和EDTA的稀Tri
21、s缓冲液中,离心,加入 MgCl2剧烈搅拌,可使一些水解酶从细胞内释放出来。,(II)自溶 向菌体中加入醋酸乙酯,甲苯,乙醚以及氯仿,使细胞渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶;,(III)酶处理 用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁,使胞内酶释放,(IV)表面活性剂 膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解,常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡,使之溶解。,二、抽 提,大多数酶蛋白是属于球蛋白,因此,可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提;抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。,1、提取的主要方法:(1)盐溶液提取(2)酸溶液提取(3)碱溶液提取(4
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