猪流行性腹泻病毒.docx

《猪流行性腹泻病毒.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪流行性腹泻病毒.docx（5页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、猪流行性腹泻病毒猪流行性腹泻病毒 简介 猪流行性腹泻病毒( porcine epidemic diarrheavirus，PEDV) 属于类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，仔猪感染此病毒后具有很高的死亡率 PEDV 是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA 5端有帽结构( cap) ，3 端有Poly( A) 尾，基因组全长为28 033bp，基因组结构如图所示5端的2 /3 部分编码2 个大的复制酶多聚蛋白ppla 和pplab，其余1 /3 基因组序列包括5 个ORF，编码4 个结构蛋白:纤突蛋白( S)、小包膜糖蛋白( E)、膜糖蛋白(M) 和核衣壳蛋白(N) 以及ORF3 编码的1

2、个非结构蛋白 复制周期 首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分的融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性的基因组RNA。融合后紧密结合的病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合的病毒RNA基因组被释放入胞质中。 首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须的单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。Rd

3、Rp以进入胞质中的基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度的亚基因组mRNA(sgmRNA)和基因组RNA,复制酶、结构蛋白和辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成的病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋的核衣壳,核衣壳与固定在内质网和高尔基体之间空隙的M蛋白结合后再与E蛋白结合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹的核衣壳。最后,包裹的核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰的三聚体S蛋白结合,形成成熟的病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。 一 蛋白组成 1. 2. 3. 4. 5. 6. 纤突蛋白 小包膜蛋白 膜糖蛋白 核衣壳蛋白 ORF3编码的多肽

4、 非结构蛋白 u Nsp1 u Nsp2 u Nsp3 u Nsp4 u Nsp5 u Nsp6 u Nsp7 u Nsp8 u Nsp9 u Nsp10 u Nsp11 u Nsp12 u Nsp13 u Nsp14 u Nsp15 7. 依赖于RNA的非结构蛋白pol基因编码 二 病毒分离 方法一 病毒粗提 从无PED病史的健康母猪场取生后2 d的新生仔猪,移入人工哺乳室人工喂奶,观察2 d, 4日龄时口服华株病毒,24 h左右发病(水泻、部分猪呕吐)。扑杀病猪,取出小肠,轻轻挤去内容物,将其纵向剪开,刮取小肠粘膜混合之,用pH7. 4的0. 01mol/L PBS(含0. 15mol/L

5、NaCl, 1mmol/L EDTA-Na2)作110稀释,反复冻融3次, 7 000g离心30m in,取上清,加PEG-6000(40% )和NaCl至终浓度分别为6%和2%, 4过夜后, 7 000g离心30m in,取沉淀,以PBS悬浮12 h以上。将重悬液15 000g离心30m in,取上清, 140 000g 4超速离心120m in,以PBS重悬沉淀,重复差速离心12轮次。将沉淀用少量PBS充分悬浮,即得粗提病毒。 病毒精提 将病毒粗制剂进行蔗糖(15%55% )密度梯度离心, 100 000g离心2 h。以长弯针头自下而上吸取各带少许,电镜观察纯度,并用紫外分光光度计测定抗原

6、蛋白浓度,用ELISA测定病毒效价。取纯度高、活性强的样品,对PBS或Tris-HCl-EDTA (TE)透析48 h,即得病毒纯化制剂,作为免疫和检测用抗原 方法二 取病死猪肠系膜淋巴结和己脱落的肠黏膜剪碎，置于无菌的研钵中，滴加5 -10倍体积 的生理盐水，反复研磨20 min，反复冻融3次后转入EP管中加入青霉素(1 000 U/mL)链霉素(300 U/mL)37水浴1h;之后经4 000 r/min离心30 min，取上清用0. 22 um的滤膜过滤之后用灭菌的EP管收集或直接取0. 6 mL接种在含有10%血清的MEM培养液中己长成单层的PK-15细胞，每隔6 - l0 h观察细胞

7、病变。 三 疫苗研发 1. 灭活疫苗 优点：组织灭活苗效果好，应用最为广泛，细胞灭活苗制备方便，应用也越 来越广泛 缺点：灭活苗产生完全免疫力需要 2周时间，且剂量偏大，安全性 2. 细胞弱毒苗 可应用 PEDV 细胞弱毒苗经口免疫晚期妊娠母猪，从而有效预防 PEDV 感染 3. 乳酸杆菌疫苗 绿色环保、可食用的多功能黏膜免疫的微生态制剂疫苗。 目前，有的实验室正在开展乳酸杆菌表达 TGEV、PEDV 主要保护性抗原基因的研究 TGEV、PEDV 的 S 基因的克隆扩增工作亦已结束 4. 转基因植物疫苗 将 PEDV的S基因转入烟草中，提取转基因植物蛋白给小鼠注射或给小鼠饲喂这种转基因植物可诱

8、导小鼠产生全身免疫和黏膜免疫 缺点：蛋白在植物中的表达水平低、表达产物在植物中的稳定性差、转基因口服疫苗在产生免疫反应之前在胃肠道内有时被消化 5. 核酸疫苗(基因疫苗、DNA疫苗) 优点：不散毒、不返强，标记性，性质稳定，制备工艺简单和费用低，长期激发机体体液和细胞免疫反应 缺点：核酸疫苗也存在整合到宿主染色体、致突变、产生抗菌素DNA 抗体等危险性 猪流行性腹泻核酸疫苗的研究还处于起步阶段，是今后研究的热点之一。 6. TGEV 与 PEDV 二联疫苗 毒价高，后海穴接种 ( 是对常规免疫途径的突破 )，增强了免疫保护力，一次接种即可，省时、省力 7. PEDV、TGEV、RV 三 联灭活苗 海农科院畜牧兽医研究所采用猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 和猪轮状病毒 (RV) 细胞培养物制备了三联灭活疫苗 PEDV 的基因组为不分节段的单股正链 RNA。其中 Pol 基因在病毒感染早期发挥重要作用，S 基因被认为是发展有效抵抗冠状病毒的主要靶抗原 ORF3 基因与病毒毒力有关，sM 基因在病毒的自我组装和出芽过程中起至关重要的作用，M 基因编码的M 蛋白可以作为 PEDV 基因工程疫苗的候选抗原，又鉴于冠状病毒 N 蛋白保守性强，所以利用 N 基因编码的 N 蛋白来建立 PEDV 分子生物学诊断技术具有很好的应用前景。