未培养和极端微生物课件.ppt

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1、未培养微生物和极端微生物的研究进展,未培养微生物的研究和应用,第一部分,经典分类方法：以形态学及其生化特征分类，不足是不能提供进化和自然的关系；经典分类的进展：以16SrRNA序列相似性为代表，序列同源性97以上定义为一个种；经典培养方法：纯培养方法不足：约有50-100万种原核微生物，目前记载不足5000种,经典微生物分类与培养,黄石公园Obsidian Pool的故事,75 95 OC,富含Fe(II)、H2S、H2、CO2,Ward采用16SrRNA方法进行了研究，发现同源性只有94.7%,Nanoarchaeum equitans来自冰岛海底热溢口的怪异新古菌,球菌：直径约为400 n

2、m基因组：500 kb与一特异古菌宿主共生极端嗜热（90）特殊rRNA：古菌中新的一界,N.equitans,Ignicoccus,99%的微生物尚属未知,Amann,Ludwig&Schleifer,Microbiol.Rev.59:143(1995),一个“看不见”的事实,微生物：分布最广 界定生物圈范围 生物量最大 占总生物量的 60%物种及代谢多样性最为丰富,一个重要的认识 自然界中已知微生物仅占总数的不到1%。,“未知微生物或许是地球上最大的尚未开发的自然资源。”James Stanley,未培养微生物（uncultured microorganisms):无法采用现有常规方法在实验

3、室里培养的微生物。常规方法：温度范围：10-70；压力范围：常压条件；pH范围：2-10；耐盐范围：低盐范围,共同协作的自然生存方式的崩溃 互养和共代谢，共栖、互生与共生；急剧改变的生态位 大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需要提供其群落中的小生态环境，即生态位；,1、未培养微生物存在的生态原因,生长环境的极度营养变化 对环境资源高亲和性的K 型，适应低营养含量和极低的生长率；潜在外源活性物质的缺乏 纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活性物质；,1、未培养微生物存在的生态原因,2.1 宏基因组技术 基本思路是直接提取环境微生物的总基因组DNA,用核酸内切酶进行部分消化,再与载体连接,转

4、入宿主细胞,构建基因文库，通过筛选文库来寻找目的基因的阳性克隆；优点：不受已知基因的同源性序列的限制,因而所获得的基因往往结构很新颖；,2、未培养微生物的分子生物学研究方法,实 例 Rondon等以细菌人工染色体作为载体构建了两个土壤未培养微生物基因组文库，筛选到41个分别编码脂肪酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，DNA序列与已知序列有很大的差异，其中一个编码的抗菌肽结构属于新的基因家族；,传统培养和宏基因组流程比较,2.2 遗传指纹图谱技术 核酸指纹图谱技术即DNA 指纹图谱法是1985年由Jeffreys 等提出，它是通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针杂交取得不同大小的

5、DNA片段的多点区带图谱，并与另一个DNA图谱比较以评价其相似性的技术。优点：不受显隐性关系、环境和发育阶段的影响，允许同时进行多样本分析；缺点：过于依赖内切酶的选用，且方法繁杂、周期长、实验条件高等缺陷而无法大范围推广；方法：梯度凝胶电泳技术，核酸杂交技术等,3.1 用低浓度的培养基来进行分离培养 一般认为,传统的培养基营养太丰富,不适合于那些原先生长在缺乏营养的环境中的微生物,如海洋微生物；实例1：Connon等用比实验室中常用的培养基营养低3个数量级,小体积、低营养的培养基来分离海洋中的微生物。从11个样品中分离出20500个培养物，其中有4个单细胞系是以前从未培养过、也从未描述过的。通

6、过这种方法，使海洋样品中浮游细菌的可培养率提高到14%，比以前提高了141400倍。,3、未培养微生物的可培养方法,让培养条件尽量模拟成原先的自然状态，如用土壤浸提物和海水滤过液来制作培养基,该方法已趋成熟；实例2：Zengler K等设计了一个非常精妙的方法，将细胞包埋在凝胶微滴板中，在低营养的流动培养液中进行培养，再用流动血细胞计数法检测微滴板上有多少个微克隆。这是一个开放流动的系统，微生物间的代谢产物及信号分子可在凝胶空隙中进行扩散而被其他菌利用。这与自然环境有很多的相似之处，因而新培养出来的微生物种类也大大增加。这种方法可用于包括土壤和海水的各种环境；,3.2 根据微生物特性 特异添加

7、营养成分变成可培养实例1：Kashefi 等根据嗜高热微生物利用Fe(III)作为终端电子受体这一高度保守的特性，在培养基中添加非常微量的Fe(III)氧化物。该方法的前提是对微生物特性有一定的了解。实例2：Santini 等从澳大利亚金矿中分出以亚砷酸为电子供体，氧为受体，以CO2 为唯一碳源的化能自养菌（NT-26）。16SrDNA 序列分析表明，NT-26 属于-Proteobacteria 土壤杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种。,环境样品混合基因组DNADNA文库目标基因/基因簇,细胞破碎、DNA提取,克隆,活性筛选,同源筛选,未培养微生物基因资源的开发基于培养非依赖（culture

8、-independent）技术的尝试,克隆酶,生物活性物质,PCR,1.环境样品DNA的提取和纯化,细胞收集法Agarose plug直接裂解法物理法：研磨、超声波、冻融、bead beating化学法：溶菌酶、Proteinase K、SDS、酚等,DNA提取,DNA纯化,CTAB、PVPP CsCl密度梯度离心、电洗脱、柱层析等,2.文库筛选,测序/基因注释活性筛选常规活性检测基于BAC的功能基因组学平台同源筛选PCR方法、分子杂交微排列技术、DNA芯片,DNA产量和回收率,国内研究实例1,王啸波等，微生物学报，2001，41（2）：133-140,Restriction digestio

9、n of three purified environmental DNA samples,分离自环境样品的纯化DNA的酶切试验,Size distribution of inserts in randomly selected clones,腾冲热泉试验文库：库容约1 Mb；插入片段为3-8 kb,环境样品DNA文库构建,环境样品DNA文库的初步评估,Gene annotation of partial DNA sequences derived from inserts in randomly selected clones,20个随机克隆插入片段 12个可预测功能开放阅读框 序列均未见报

10、道,研究结果简要分析,研究结果简要分析,20个测序样品中，14个为新序列；14个序列中12个含可预测功能的基因；样品e6含编码硫氧蛋白还原酶基因一部分；样品9918含蛋白二硫键异构酶基因一部分；,为相关酶的性能改造提供基础,Davies的工作(1997),土壤样品,混合基因组DNA,Polyketide synthase基因,PCR,国外研究实例1,J.Davies(1997),从土壤中直接获得全长KSb基因的策略,J.Davies(1997),KSa和KSb基因产物的系统发育学关系,Handelsman和Goodman的工作(1998),土壤样品,混合基因组DNA,元基因组文库（BAC文库）

11、,酶、小分子活性物质,元基因组（metagenome):环境中所有微生物基因组的总和。,国外研究实例2,Handelsman&Goodman(1998),两个土壤元基因组文库（库容：1 Gbp）,Handelsman&Goodman(1998),Handelsman&Goodman(1998),未培养微生物系统发育学分析与生物学分析的偶联,基因簇的克隆,Handelsman&Goodman(1998),Osburne et al.(2000),抗细菌活性的筛选,Diversa公司(1995-)未培养微生物基因资源大规模开发的先驱,采集全球各种生态环境样品高效筛选新基因、基因簇针对不同应用需要优

12、化基因及基因簇获得高效、高稳定性酶和小分子生物活性物质,5,000 genomes109 clones,108109 clone.assays/day,Diversa产品,“酶订购计划”数百种新酶ThermalAce DNA polymerase(由Invitrogen销售）Replicase,微生物世界的淘金者,DiversaARIAD Pharmaceuticals,Inc.TerraGen Discovery,Inc.Khosan Biosciences,Inc.Maxygen,Inc.,新世纪的挑战,任务：了解自然界中微生物的种类、相互作用、对环境的影响；开发微生物资源解决方案代表性生

13、态环境的系统生态学研究发展新的富集培养和分离策略，结合采用分子生物学和培养依赖方法，研究未培养微生物 微生物系统科学：技术集成、学科集成,极端微生物及其生物技术价值,第二部分,一、极端微生物的概念,研究的需求：许多工业过程需要高压、高温、低温、高盐碱或耐辐射条件，一般生物催化剂难以胜任苛刻条件下的工作；定义：是依赖于一种或多种极端物化因子的极端生命形式，在100以上或0以下、近饱和的盐度、pH10或pH2、高压和放射条件等极端环境下的极端生命形式.,二、极端微生物的类型,嗜热菌(thermophiles)嗜冷菌(psychrophiles)嗜碱菌(alkaliphiles)嗜酸菌(acidop

14、hiles)嗜盐菌(halophiles)嗜压菌(barophiles),三、极端微生物的应用潜力,PCR技术中的高温Tag DNA聚合酶；洗涤剂中的高温蛋白酶和脂肪酶、碱性蛋白和脂肪酶；极端嗜盐菌生产PHB、核苷酸，将大大简化后处理工艺，降低生产成本；油田的油层多为极端环境（高温、高压、高盐、厌氧），一般微生物难以发挥作用，极端微生物将会带来采油技术的一场革命,极端微生物的应用潜力,在含硫的低品位矿床中，硫杆菌可产生大量硫酸，使pH降得很低，溶出很多贵重金属。对极端嗜酸菌特别是嗜酸嗜热菌的深入研究，已实现了湿法冶金；污染环境中，盐碱度高、毒物浓度高、环境温度低，普通的生物技术治理难有作为，而

15、极端微生物可在高盐碱、低温条件下行使最佳功能，在环境整治中将大有作为。,极端微生物的应用潜力,极端微生物具有多样的代谢类型，通过对代谢途径的认识与改造，极端微生物可过量积累有机酸、氨基酸等，实现超级生产；嗜热微生物可实现酒精的真正高温发酵，实现酒精在发酵过程中的分离蒸馏，引发酒精生产工艺的划时代变革；,极端微生物的应用潜力,农产品加工中，一般生物过程无法实现对纤维素、半纤维素的有效转化。在极端条件下行使功能的极端微生物及其极端酶可在高温、酸、碱等条件下对秸杆、废渣等进行处理，为解决资源的有效转化利用提供新途径。极端微生物已经适应了各种各样的极端环境，因而提供了一个特有的遗传信息来源，从中发掘新

16、型产物极具潜力.,四、极端微生物的国内外研究进展,美国近年来非常注重极端微生物的研究，不仅在基础研究方面开展了系统的工作，在极端微生物的生物技术利用方面已经开始实用化，高温DNA聚合酶、碱性酶及极端采油菌已在产业上产生了重要影响，为推动整个生物技术领域的发展、协调环境与可持续发展等方面作出了重要贡献。在基因芯片、新材料、新药等方面，对极端微生物的作用也有很高的期望。,极端微生物的国内外研究进展,欧洲是开展极端微生物研究较早的地区，他们主要研究极端微生物生命机理的分子基础及新酶、新产物的开发。欧盟于97年启动一个耗资1200万美元的计划“极端细胞工厂”，探索极端微生物在不同工业中的可能用途，已于

17、99年11月结束。作为欧盟的整体策略，极端微生物项目的目的是“利用生物技术改造现在的化学工业过程”，项目协调人Antrinikan教授认为，极端微生物工业的时代已经到来。,极端微生物的国内外研究进展,日本对极端微生物研究起始于1968年，K.Horikoshi教授有极端微生物研究之父之称，正是他的工作使人们认识到了极端微生物的价值。他们开发了大量的嗜碱菌及其碱性酶，获得了20多种碱性酶的专利，碱性纤维素酶、环糊精酶、蛋白酶等都在工业中得到了实际应用。,1991年日本开始实施了著名的深海之星（Deep-star）计划，耗资50亿日元进行为期5年深海极端微生物的研究，现在每年仍维持300万美元的资

18、助，从深海中获得了1000多株嗜压、嗜冷、嗜热、嗜碱及耐有机溶剂的多类型的极端微生物，最引人注目的则是耐有机溶剂菌，可耐受的溶剂浓度可达50。,极端微生物的国内外研究进展,极端微生物菌株发现,获得了产生耐热、盐、碱、酸的酯酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、过氧化氢酶等酶的极端微生物237株，完成了其中183株菌的系统发育学分析，获得新的分类单位。发现了一些极端微生物类群与产酶关系,如首次证明了Halomonas和Bacillus rRNA 第7类群是碱湖中主要的多糖水解酶产生者.,我国的研究进展实例,盐湖分离的部分嗜盐古菌产酶分析,淀粉酶：35 株,酯酶：65株,蛋白酶：24株,产水解

19、酶嗜碱菌的系统发育分析,建立环境基因文库168M 环境基因文库构建技术和高通量筛选技术 分离新酶基因6个,环境基因文库构建与酶基因筛选,环境基因文库,热泉样品DNA文库120Mb 载体为pCRT7/CT-TOPO,盐碱湖样品DNA文库48Mb 载体为pUC19，插入片段2-6kb,1，高温alpha-glucosidase gene：2.2kb,与其它酶的相似性小于51，2，碱性-mannanase gene，1479bp,与其它酶的相似性小于59 3，碱性-amylase gene：1761bp,与其它酶基因相似性小于30 4，高温6-phosphate-beta-glucosidase 2

20、.4kb,与其它酶的相似性小于51 5，酸热-mannanase gene，27%partly to endo-1,4-beta-mannocidase6，碱热酯酶基因,新基因,获得6个新基因,极端酶纯化表征与结构功能,碱性过氧化氢酶 分子量140kd 温度20-40,pH11碱性淀粉酶 分子量 60kD 温度50，pH10碱性甘露聚糖酶 分子量 50kD 温度70，pH9.5酸性甘露聚糖酶 分子量 38kD 温度65，pH5.5 高温葡萄糖苷酶 分子量 92kD 温度65，pH5.7 分子量102kD 温度90，pH6,结构与功能研究位点突变与酶特性的关系,野生型甘露聚糖酶及其突变型特性比较

21、,野生型甘露聚糖酶及其突变型预测的三维结构的比较,已获得结晶，为揭示酶结构与功能、酶多样性的结构机制奠定了基础。,收集不同种属的海绵5种,从繁茂膜海绵分离的放线菌，大部分属于链霉菌属Streptomyces，一些分属6个稀有放线菌属。其中一株与Actinoalloteichus cyanogriseus，相似度为96.7%，可能是一新种。,放线菌300株细菌100株真菌100株甲壳素降解酶过氧化物酶,海洋微生物多样性,Effect of organic solvents（50）on the activity of YP1A protease,50%(V/V)organic solvent,40

22、 C,200 rpm for 2 h.The tube with the addition of buffer instead of solvents was used as control.,Effect of organic solvents on substrate specificity of YP1A protease,Nundissolved,The YP1A protease showed different substrate specificity responding with the different solvents,Effect of organic solvent

23、s on the activity of LP8 lipase,A novel lipase with high activity in organic solvents from Pseudomonas aeruginosa YJ01,25%(V/V)organic solvent,40 C,140 rpm for 3 h,五、极端微生物的商业应用,1997年Genecor公司推出了碱性纤维素酶103作为洗涤剂的添加剂，预计该酶的年市场销售额可达到6亿美元。美国Diversa公司自1994年底成立以来，已获得340多种新型极端克隆酶。这些酶具有在某些极端条件下（高温、低温、极端pH、高盐、有

24、机溶剂等）稳定的特性，因而可以满足某些工业应用的特殊需要。,六、极端微生物的研究进展,60年代主要研究极端环境微生物生态、新菌种的分离鉴定、理化特性及酶的筛选应用；90年代后期，极端微生物的研究蓬勃发展，对极端微生物的系统分类、生态、生理、生化、遗传以及生物技术利用开展了系统的研究；研究主要类群包括低温、高温菌，嗜盐菌，嗜碱菌、嗜酸菌，嗜压菌，及有机溶剂、辐射等因素相关的其它极端菌。,1、嗜热微生物的研究,发现的嗜热菌已有20多个属，包括古菌及细菌，一般最适生长温度在90以上的微生物，温度的上限已到113C，在系统进化、蛋白质结构与功能及热稳定酶的应用等方面的贡献突出；如斯坦福大学学者发现的古

25、细菌，最适生长温度为100，降到80以下即失活；美国的巴罗斯发现一些从火山口分离出的细菌可以生活在250的环境中；,嗜热菌的适应机理,蛋白质的稳定性高：氨基酸组成以Leu、Pro、Glu和Arg为主，具有较高荷电氨基酸组成和平均疏水性，有利于高温下蛋白质结构的稳定性；另稍长的螺旋结构、三股链组成的折叠结构、以及C末端和N末端氨基酸残基间的离子作用，有利于形成紧密而有韧性的结构；细胞被膜结构：除具有肽聚糖外还有六角形排列的外膜蛋白组成的类似鞘的外层结构，如能在110生长的细菌具有蛋白表面层（PS）或糖蛋白表面层（GPS）组成，其中GPS在碱性2%的SDS煮沸下都不破坏，可保持细胞的形态；,嗜热菌

26、的适应机理,不同的代谢途径：嗜热脂肪芽孢杆菌中的磷酸甘油脱氢酶在90仍稳定；菌体内特有酶：超嗜热古细菌含有一种逆促旋酶，90活性最高，形成的正性超螺旋能增加DNA分子双链的拓扑环数目，有助于DNA在特殊高温下维持状态，避免变性；,2、嗜冷微生物的研究,嗜冷菌的研究远不如嗜热菌那样广泛，主要分布在南北极、高山、土壤及深海微生物中；嗜冷微生物主要有：真细菌、蓝细菌、酵母菌等；生长温度：嗜冷型0-15，耐冷型0-5，高于10无法生长；,嗜冷菌的适应机理,膜组分的变化：脂类组成脂肪酸随温度变化，不饱和脂肪酸在低温下向饱和脂肪酸转变；重要代谢产物的生成：细胞质内海藻糖含量变化可增强失水生存能力，避免因温

27、度降低而导致胞内形成冰晶；同时糖类的羟基与磷脂的磷酸基形成氢键，阻止膜失水融合，并降低相变温度，不易向凝胶相转变，从而增加膜的流动性，提高抗冷能力；,嗜冷菌的适应机理,具有大量带负电的氨基酸残基：底物易接近活性中心，具有相对柔韧性和小的功能域；酶分子松散，有较大可变性；菌体内特有酶：部分酶对温度敏感，属冷活性酶类；冷休克蛋白：增强微生物的低温限制；,嗜盐古菌已有9个属,在区系生态方面，死海、非洲盐碱湖的研究当属典型，获得了大量资源;从死海、死谷，我国的新疆和内蒙古的盐碱湖中分离得到，一般生活在10-20%的盐溶液中；嗜盐菌的生理、生化及遗传是极端微生物学科中的传统内容，由于嗜盐菌的产物不易在普

28、通受体系统中表达活性，嗜盐菌的遗传系统也是人们热心的内容;嗜盐菌的应用潜力表现在相似性溶质、酶、多聚物、脂质体、医药以及环境整治等方面。,3、嗜盐极端微生物的研究,嗜盐菌的适应机理,膜组分的变化：在高盐低氧环境中主要以细菌视紫质（如视紫醛蛋白）为代表，这种光驱“质子泵”可弥补高盐下底物有氧氧化的能量不足；重要代谢产物的生成：细胞内能积累高浓度钾离子或钠离子（4-5mol/L)；或胞内积累大量小分子极性物质，如甘油、单糖等，均可帮助细胞从高盐环境中吸取水分细胞壁成分不同：不含肽聚糖而以脂蛋白为主；菌体内特有酶：部分酶含有较高酸性氨基酸比率，使酶分子表面具有水保持层，从而阻止酶分子的相互凝集；,4

29、、嗜碱微生物的研究,多数生活在盐碱湖、碱湖或碱池中，生活pH11.5以上，最适pH8-10；嗜碱菌的生理学知识仅建立在兼性嗜碱芽孢杆菌OF4及C125研究的基础上，嗜碱菌真正的生理机制还是个谜;嗜碱菌的蛋白不能在普通受体中表达或正确折叠，但对嗜碱菌的受体系统还没有任何努力;嗜碱菌及其酶的应用潜力极大，商业期望值最高，仅用于洗涤剂的碱性纤维素酶的预计市场为6亿美元；,5、其他类型极端微生物的研究,嗜酸微生物主要生长在酸性环境：硫矿、金属硫化酸性矿水、含硫的酸性土壤和煤矿排出水等；生长pH一般为1-5；嗜酸微生物的适应机制主要有：泵说、屏蔽说和柯南平衡说，主要以屏蔽说为主；嗜压微生物一般生活在深海

30、底，多数生长在0.7-0.8MPa,有的高达1.04MPa以上；但具体的适应机制不十分清楚；,5、其他类型极端微生物的研究,嗜辐射微生物能在紫外光、电离辐射和部分可见光的辐射环境下生存，主要是微生物体内具备相应的DNA光修复系统和自由基清除酶，来适应环境；寡营养菌、高渗菌和毒物耐受菌等亦进行了研究，同时人们也在寻找其它更奇怪的类群，并向空间及其它星系发展；,5、其他类型极端微生物的研究,关于嗜酸、嗜压特性的研究常被嗜热菌、嗜冷菌的研究所掩盖，实际上了解不多，而其价值与潜力已被人们所注意；寡营养菌、高渗菌、毒物耐受菌、高辐射菌、深海深地高压菌等亦进行了研究，同时人们也在寻找其它更奇怪的类群，并向空间及其它星系发展；,七、极端微生物的研究发展趋势,由于极端微生物生理上的特殊性，其筛选、保藏、培养等过程都需要开发和采用新的方法和技术；对极端微生物的生理、代谢的物质基础以及遗传背景了解还不多，所能利用的基础与手段还有限；基因组学及后基因组的发展，将极大地推动极大微生物的研究；,讨论题（9.30/10.11）,1.海洋未培养微生物的研究实例;2.宏基因组技术在未培养微生物研究中应用；3.极端嗜热微生物的研究进展；4.极端嗜冷微生物的研究进展；5.极端嗜酸微生物的研究进展；6.极端嗜碱微生物的研究进展；7.极端嗜压微生物的研究进展；8.极端嗜盐微生物的研究进展；,