电泳基本理论课件.ppt
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1、电泳基本理论,哈尔滨医科大学生物化学教研室,袁丽杰,内容摘要,1,概述,2,电泳的基本原理,3,电泳系统,4,支持介质,5,染料,6,影响因素,1,电泳概述,1.1,电泳的定义,带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极方,向移动,这种现象称之为电泳,(electrophoresis,,简称,EP),。,电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不,同而对物质进行分离的一类实验技术。,带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的,速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度,和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度,除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的
2、,带电性质及数目等因素有关。,1.2,电泳技术的发展过程,电泳现象早在,1808,年就已经被发现,但电泳作为一种分,离技术却是在,1937,年由瑞典科学家首先提出来的,并设计,出世界上第一台自由电泳仪,建立了“移界电泳”分离模,式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界,面的移动,首先证明了血清是由白蛋白、,1,、,2,、,和,球,蛋白组成的,为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献,,1948,年他被授予诺贝尔奖。,20,世纪,50,年代,以支持介质为主的电泳模式不断涌现,如滤纸、,醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。,60,年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法,如,聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝
3、胶电泳等。,1967,年在凝胶电泳的基础上建立了,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶,电泳技术。,70,年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式,如圆盘,电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳,、印迹转移电泳等技术。,90,年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。多年来,科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作,建立了各种,实验方法,电泳后对分离物质可以用染色、扫描、紫外吸,收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析,得到所,需数据。,1.3,电泳的常用术语,(1),电泳迁移,(electrophoretic,migration),:,在电泳过程中,带电粒子在电场的作用下做定向移动,,单位是,c
4、m,。,(2),迁移时间,(migration,time),:用,t,m,表示,在电泳过程中,带电粒子在电场的作用下做定向移动,所用的时间,单位是,min,。,(3),电泳速度,(electrophoretic,velocity),:用,V,ep,表示,在单位时间内,带电粒子在电场的作用下做定向运动,的距离,单位是,cm,/sec,。,(4),电场强度,(electric,field,strength),:用,E,表示,在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电,效应,单位是,V/cm,。,E=V/L,t,式中,V,为电压,,L,t,为两端电极的距离。,A,B,(5),电渗流,(elect
5、roosmotic,flow),:用,EOF,表示,在电场中电泳溶液的正电荷与固体支持物表面上的负电荷,之间相互作用,形成一个正离子层,导致流体朝负极方向,移动,称为电渗流,这种现象也称之为电渗,(electroosmosis),现象,如图。,电渗流迁移速度,(V,ep,),的表达式为:,?,电渗流迁移速度,V,ep,=,?,E,4,?,式中,?,为电解常数,,?,为支持物与表面平切面的,Zeta,电势,,,?,为缓冲液粘度,,E,为电场强度。,通常情况下,电渗流总是由正极向负极移动,只有在特,殊情况下如分离碱性蛋白质的阴极电泳时溶液,pH,较低,,固体支持物表面带正电荷,形成向正极移动的电渗
6、流。电,渗流的大小受到,Zeta,电势,偶电层厚度和缓冲液粘度等因,素的影响,直观地看电渗流随着电解质浓度的增加而增加,,随着,pH,值的增加而加大。,(6),相对迁移率,(relative mobility),:用,m,R,表示蛋白,质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁,移率,即,蛋白质的迁移距离,(cm),m,R,=,示踪染料的迁移距离,(cm),2,电泳的基本原理,2.1,带电颗粒,溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附其它带电,质点而带电,在电场中就会发生迁移,移动方向取决于它,们的带电符号。,NaCl,Na,+,+,Cl,生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在
7、溶,液中,它们的净电荷取决于溶液终的,H,+,浓度,2.2,电泳迁移率,(mobility),如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中,,使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效,电荷,Q,和电位梯度,E,,即:,F,=,QE,(1),带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力,F,,对,于球形颗粒来说,在自由溶液中此阻力服从,Stock,定律:,F,=,6,r,v,(2),这里,v,是在介质粘度为,的溶液中,半径为,r,的带电颗粒,的移动速度。但在凝胶中,这种阻力并不完全符合,Stocks,定律。,F,还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大,小和介质的内渗等。,当带电颗粒
8、达到稳态运动时,,F=F,,由,(1),、,(2),式推导,出:,v,Q,=,(,3,),E,6,r,不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同,其泳动速,度用迁移率(或称泳动度),m,来表示,定义为在电位梯度,E(V/cm),的影响下,颗粒在时间,t(s),中迁移距离,d(cm),,即,在单位电场强度,(1,V/cm),时的泳动速度:,v,d,m,=,=,(4),E,t,E,将,(3),代入,(4),,得到,Q,m,=,(5),6,r,由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒,所带电荷有关。在确定的条件下,某物质的迁移率为常数,,是该物质的物化特性常数。从,(4),式可以导出迁移率的,单
9、位是,cm,2,s,-1,V,-1,。,2.3,带电颗粒的移动速度,v,与电位梯度,E,、电流密度,J,和导,电性,K,的关系,如果在同样实验条件下对某蛋白溶液做两个电泳试验,,一个试验用两倍的时间一倍的电压,另一个试验用一倍的,时间两倍的电压,从理论上讲,这两个试验中蛋白质的迁,移距离应该是相等的。但是实际上只能是大致相等,原因,是在电泳过程中还有其他因素的干扰,如在增加电压的同,时也增加了热效应。移动的速度决定于其分子的形状、相,对分子质量的大小、分子带电性质及数目,还与分离介质,的阻力、溶液粘度及电场强度等因素有关。,我们把带电颗粒的移动速度用以下公式表示,v,=,m,E=,m,J/K,
10、(6),由此可以看出,带电颗粒的移动速度,v,等于电位梯度,E,和,迁移率,m,的乘积,与电流密度,J,和迁移率,m,的乘积成正比,,与溶液的导电性,K,成反比。也就是说,电场强度越高电,泳速度越快;溶液的导电性越强,电泳速度越慢。因此电,泳速度随着电位梯度或溶液的导电性的变化而改变。,3,电泳的分类,3.1,按分离原理分类,(1),区带电泳,(zone,electrophoresis,,,ZEP),:是在半固相或,胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液,然后在介质上加,电场,带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移,在电泳,过程中,不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独,立的区带,(,图,3-2
11、a),,这是当前应用最广泛的电泳技术。,(2),移界电泳,(moving,boundary,electrophoresis,,,MBEP),:,是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上,,带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定,(,图,3-2b),。,(3),稳态电泳,(steady,state,electrophoresis),:带电颗粒在,电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态,此后,,电泳条带的宽度不随时间的变化而变化,,如等速电泳,(isotachophoresis,,,ITP),、,等,电,聚,焦,电,泳,(isoelectric,focusing,,,IEF
12、)(,图,2c,、,2d),。,a,b,c,d,图,3-2,各种电泳分离原理示意图,a,区带电泳,b,移界电泳,c,等速电泳,d,等电聚焦,4,电泳系统,4.1,电泳仪及附属设备,从第一台商品自由移界电泳系统的问世以后,近,50,年来,电泳仪器的发展迅猛,尤其是随着凝胶电泳技术的成熟及,广泛应用,各种类型的凝胶电泳装置层出不穷,使电泳技,术得以迅速发展。凝胶电泳仪作为实验室的常规小型仪器,,种类很多。随着科学技术的不断发展,电泳仪器的分析,对象也越来越专门化,分辨率越来越高,操作越来越简单,,性能越来越稳定。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳,槽及附属设备三大类。,4.2,电泳仪:,根据电泳仪的
13、电压设计范围可将其分为三类:,(1),常压电泳仪,(600V),:用于净电荷和,SDS-,聚丙烯酰胺凝,胶电泳;,(2),高压电泳仪,(3000V),:用于载体两性电解质等电聚焦电,泳和,DNA,测序;,(3),超高压电泳仪,(30000-50000V),:用于毛细管电泳。,4.2,电泳槽:,根据电泳种类不同,对电泳槽的设计也不一样。电泳,槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。,(1),自由界面电泳槽,Tiselius,设计的自由界面电泳槽(图,3-3,)是一个,U,形玻璃,管,在,U,形管下部放待分离的蛋白溶液,管臂联接到电极,上,在电场的作用下,缓冲系统中蛋白质界面的移动可用,光
14、学系统“纹影法,(schlieren)”,照相,得到电泳图谱。这种,电泳槽目前已不使用。,90,年代初发展起来的高效毛细管电,泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。,电极,电极,U,形管,3,Tiselius,自由界面电泳装置示意图,(2),管状电泳槽,50,年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个,电泳槽和带有铂金电极的盖,上电泳槽具有若干个孔,可,插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内,凝胶在电,泳管中聚合成柱状胶条,样品经电泳分离,蛋白区带染色,后呈圆盘状,因而称圆盘电泳,(disc,electrophoresis),。,圆盘电泳槽,(3),板状电泳槽,板状电泳槽是目前使用最多
15、的电泳槽,是将凝胶灌装在,两,块,平,行,的,玻,璃,板,中,间,,,因,而,称,板,状,电,泳,(slab,electrophoresis),。板状电泳的最大优点是包括标准相对分,子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条,件下进行电泳,便于利用各种鉴定方法,直接比较各样品,的区带,保证结果的准确可靠;还可进行双向电泳。另外,,板胶电泳时产生的热量容易消散,凝胶电泳结果便于照,相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳,槽。,垂板电泳槽,转移电泳槽,平板电泳槽,双向电泳槽,制备电泳槽,4.3,附属设备,随着电泳技术的发展,电泳技术的种类逐渐增加,凝胶,电泳在制胶、电泳系统的冷
16、却、凝胶染色及结果分析等方,面手段日趋完善,科学家们研制出各种电泳附属设备,如,梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、,凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。,5,电泳的操作模式,目前最常用的电泳操作模式是区带电泳中的聚,丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳,前者主要,用于蛋白质的分离鉴定,后者主要于核酸的分析,鉴定。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理,分类。,5.1,按电泳方式分类,(1),端电极电泳:有垂直式和水平式两种方式,多用于蛋,白质电泳。,(2),搭桥电泳:为水平式,水平板状电泳槽形式多样,凝,胶和缓冲液通过间接接触的方式,如用滤纸桥搭接,用缓,冲液制作的凝胶条或滤纸条搭接(图,3-
17、4,),后两者即半,干技术,多用于免疫电泳、等电聚焦。,A,B,C,图,4,水平板状电泳中凝胶与缓冲液的接触方式,A,滤纸桥,B,凝胶条,C,滤纸条,(3),潜水电泳:,为水平式,电泳时凝胶浸于缓冲液中,多用于核酸电泳。,5.2,按分离原理分类,(1),净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳;,(2)SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳;,(3),聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳;,(4),聚丙烯酰胺凝胶双向电泳;,(5),聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦;,(6),聚丙烯酰胺凝胶转移印迹电泳;,(7),琼脂糖凝胶水平电泳;,(8),琼脂糖凝胶脉冲电泳;,(9),琼脂糖凝胶免疫电泳。,6,凝胶电泳的支持介质,6.1,支持介质的性质,采
18、用支持介质进行电泳的目的是防止在电泳过程中分子,的对流和扩散,使被分离物质得到更有效的分离。支持介,质应当具备以下特性:,(1),物理化学性质稳定:在电泳过程中不受环境因素的影,响,保持原有的状态和性能。,(2),化学惰性:在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子,和待分离的生物大分子发生化学反应,不干扰生物大分子,的电泳过程。,(3),分布均匀:内电渗小,结果重复性好,6.2,支持介质的分类,电泳的固体支持介质可以分为两类,:,(1),薄膜类:,薄膜类包括纸类,醋酸纤维素薄膜,聚酰胺薄,膜等,.,这类支持介质化学惰性好,在电泳过程中产生的,对流和扩散较小,分离的基本原理主要是基于生,物大分子的电
19、荷密度。,(2),凝胶类:凝胶类包括淀粉凝胶,琼脂糖凝胶,聚丙烯,酰胺凝胶等。,这类介质相对薄膜类又了进一步,它具有高粘度和高摩,擦阻力,它在电泳过程中不仅能防止对流,减小扩散,还,具有凝胶的多孔性,孔径与蛋白质分子大小大致相同,因,而能产生分子筛效应,(molecular,sieving,effect),,其分离作,用既与电荷密度有关,又与分子大小有关,因而凝胶的分,离原理是基于大分子的电荷密度和分子大小,对分离不同,相对分子质量的生物大分子极为有利。所以,生物大分子,如蛋白质和核酸电泳多采用凝胶类介质。淀粉凝胶由于质,量难以控制,操作繁琐,分辨率低,实验室中已很少使用,,现在用得最多的是聚
20、丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。,7,凝胶支持介质,7.1,聚丙烯酰胺凝胶,7.1.1,聚丙烯酰胺凝胶的特性,聚,丙,烯,酰,胺,凝,胶,(polyacrylamide,gel),是,由,单,体,(monomer),丙,烯,酰,胺,(acrylamide,,,简,称,Acr),和,交,联,剂,(crosslinker)N,N,-,甲,叉,双,丙,烯,酰,胺,(N,N,-methylenebi,sacrylamide,,简称,Bis),在催化剂和加速剂作用下聚合交联,而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称,为聚丙烯酰胺凝胶电泳,(polyacrylamide,gel,electrophor
21、sis,,简称,PAGE),。聚丙烯酰胺凝胶用于电泳的支持介质,与,其它凝胶相比,聚丙烯酰胺凝胶具有以下优点:,(1),孔径大小与生物大分子具有相似的数量级,具有良好,的分子筛效应。根据待分离大分子的相对分子质量,通过,改变凝胶浓度及交联剂度来调节凝胶的孔径,使大分子得,到较好的分离。,(2),在一定浓度范围内,凝胶透明,有弹性,机械性能好,(3),凝胶是由,C,C,C,C,结合的酰胺类多聚物,侧,链上具有不活泼的酰胺基,没有其它带电基团,所以凝胶,性能稳定,电渗作用小,无吸附,化学惰性强。与生物大,分子不发生化学反应,电泳过程中不受温度、,pH,的变化,的影响。,(4),具有高分辨率和灵敏度
22、,尤其是在不连续电泳系统中,,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体,样品不易扩散。并有,多种染色方法提高电泳条带显色的灵敏度,分离蛋白质的,灵敏度可达,10,-6,g,。,(5),单体纯度高,在相同的实验条件下,电泳结果具有很,好的重复性。,(6),凝胶杂质少,在很多溶剂中不溶,可适用于少量样,品的制备,不致污染样品。,以聚丙烯酰胺凝胶为支持物发展起来的电荷聚丙烯酰胺,凝胶电泳、,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺梯度,凝胶电泳、等电聚焦及双向电泳等电泳技术,不仅能分离,、小量制备生物大分子,而且可以用来研究生物大分子的,性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。,7.1.2,聚丙烯酰胺凝胶
23、的聚合方式,聚,丙,烯,酰,胺,凝,胶,聚,合,机,理,是,通,过,提,供,氧,游,离,基,(free,radicals),的催化,使体系发生氧化还原作用,(catalyst-redox,systems),来,完,成,的,。,催,化,体,系,主,要,有,化,学,催,化,(,AP,TEMED,)和光化学催化(核黄素,TMTED,)体系。,(1)AP-TMTED,催化体系:属于化学聚合作用,,TMTED,是一种脂肪族叔胺,分子式为,H,3,C,/CH,3,N(CH,2,),2,N,H,3,C/CH,3,它的碱基可催化溶液中的,AP,使其形成游离氧自由基,,激活,Acr,单体形成单体长链,同时在交联
24、剂,Bis,的作用下长,链彼此交联聚合成凝胶,反应式如下:,TEMED,催化,AP,生成硫酸自由基:,S,2,O,8,2,2SO,4,硫酸自由基的氧原子激活,Acr,单体并形成单体长链:,Bis,将单体长链间连成网状结构:,聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂,的浓度、,pH,、温度、分子氧和杂质都会影响凝胶的聚合,过程。,(2),核黄素,-TEMED,催化系统:属于光聚合作用,聚合原,理是核黄素在光照条件下分解,被还原成无色核黄素,后,者在有少量氧的条件下,被氧化形成自由基,从而引发聚,合反应。,7.1.3,凝胶总浓度及交联度与凝胶的性质:,(1),凝胶总浓度与凝胶特性:,凝胶溶
25、液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚,丙烯酰胺凝胶特性,包括其机械性能、弹性、透明度、粘着,度及孔径大小的主要参数。,1962,年引入两个计算公式,即凝,胶总浓度(,T,)是表示凝胶溶液中单体和交联剂的总百分含,量,a+b,T,=,100%,m,交联度(,C,)是表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总,量的百分含量。,b,C,=,100%,a+b,式中,,a,为丙烯酰胺单体的质量,(g),,,b,为交联剂,N,N,-,甲叉双丙,烯酰胺的质量,(g),,,m,为溶液的终体积,(ml),。,凝胶,a,、,b,的比例是很重要的,决定了凝胶的物理性状。,当,a:b,小于,10,时,凝胶脆且硬,不
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