实验四 线粒体的分离与观察.docx

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1、实验四 线粒体的分离与观察实验八 线粒体的分离与观察 实 验 目 的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实 验 原 理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含

2、物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素

3、氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I鸡肝线粒体的分离 实 验 用 品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 21詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 molL蔗糖+0.01molL Tris-盐酸缓冲液： 0.1 molL三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10 ml 0.1 molL盐酸 8.4 ml 加重蒸水到 100 ml 加蔗糖到0.25 molL。蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖 4. 0.34 molL蔗糖0.01molL Tris-盐酸缓冲液 5. 固定液：甲醇-冰醋酸(9：1) 6. 姬姆萨染液：Giemsai粉

4、0.5g，甘油33 ml，纯甲醇33 ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内研磨至无颗粒，再将剩余甘油到入混匀，56左右保温2h令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。用时吸出少量用1/15 molL 磷酸盐缓冲液作1020倍稀释。 1/15 molL 磷酸盐缓冲液作(pH6.8) 115 molL KH2PO4 50 ml 115 molL Na2 HPO4 50 ml 三、器材 高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物、玻璃匀浆器。 实 验 方 法 1. 制备大属肝细胞匀浆。实验前鸡空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取

5、肝组织2g，剪碎，用预冷到04的025 molL缓冲蔗 糖溶液洗涤数次。然后在04条件下，按每克肝加9ml冷的0.25 molL缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 2. 差速离心。先将9ml 0.34 molL缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入9ml 肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻控温高速离心机按图10-1顺序进行差速离心。 3. 分离物鉴定。 (1) 细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，入甲醇冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液(原液1020倍稀释)染色

6、10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。 (2) 线粒体：取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密)，不待干即滴加1詹纳斯绿B染液染20min覆上盖玻片，镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。 鸡肝匀浆700g离心10min 沉淀 洗涤 10 ml预冷的0.25molL 缓冲蔗糖溶液2次， 每次1000g离心15 min 合并 上清液 沉淀 上清液 10000 g 离心 10 min 沉淀 洗涤 加10 ml预冷的0.25molL 蔗糖溶液2次， 每次1000g离心15 min 上清液 上清液 图 10-1 差速离心顺序图 沉淀 实 验 注 意 事 项 如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻，保持其生理活性。 作 业 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。 思 考 题 1. 分离介质0.25 molL及0.34 molL缓冲蔗糖溶液哪一种在下层?有什么作用? 2. 分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置室温2h后再染色，比较二者着色的差异。