生物大分子的分离纯化和鉴定课件.ppt

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1、生物大分子通常是指在生物体内存在的或生物体代谢产生的具有特殊生物学功能的高分子化和物，主要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。生物材料的选择与处理 一、选择生物材料原则：有效成分含量高，稳定，来源丰富，保持新鲜，提取工艺简单，成本低。如：用酵母提RNA，用牛奶提酪蛋白，用大蒜提SOD(超氧化物歧化酶)二、生物材料处理：1、动物脏器：冰冻：-10冰库（短期保存）-70低温冰箱（数月）干燥：可长期保存,2、植物组织：10小时内置-4-30冰箱储藏备用3、微生物：胞外产物（如发酵液），低温短时储藏。胞内产物，则应收集菌体或细胞，制成冻干粉于4保存（数月不变质）除了体液和微生物胞外的某些蛋白质和多肽以外

2、,大多数生物大分子都存在于细胞之内.,细胞破碎 1、酶学破碎法：外加酶制剂、自溶法。2、机械破碎法：高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法 3、物理破碎法：温差法、压差法、超声波 4、化学破碎法：有机溶剂法、表面活性剂（SDS 等）金属螯合剂（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化学变性剂。,蛋白质的分离纯化,依据蛋白质在溶液中的性质不同（溶解度、电荷、相对分子质量的大小，特异亲和力等）确立的蛋白质和酶的分离方法.其性质包括:。（1）利用溶解度差别的分离方法1、等电点沉淀：蛋白质在等电点时溶解度最小。当蛋白质混合液的PH值被调到其中某一种成分的PI时，该种成分蛋白质将会沉淀下来，这种沉淀出来的蛋白质保

3、持着天然构象（活性）能再溶解。高于或低于该PI的蛋白质留在溶液。如：Glu的生产也是利用此性质进行的，Glu PI 3.22。,2、盐析 高浓度的盐（常用硫酸铵）可以降低蛋白质的溶解度。因为高浓度盐争夺了蛋白质分子的水膜层，降低了环境中水的相对浓度，还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和度由低到高逐次增加，如血清中加入50%饱和度的(NH4)2SO4可使球蛋白析出，加入100%饱和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，达到分级分离的目的.盐析后必须脱盐。脱盐最常见的方法是透析法，也可以用凝胶层析（葡聚糖凝胶SephadexG25脱盐）

4、、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点沉淀法相结合使用。脱盐是否彻底，要经常进行检查。如除去(NH4)2SO4可用10%BaCl2检查；除去NaCl可用10%AgNO3检查，直到透析液中检测不出BaSO4或AgCl为止，透析完成。,3、有机溶剂分级法 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数，水是高介电常数（20时，80），有机溶剂是低介电常数物质（20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4），因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面的可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，

5、与蛋白质争夺水化（膜）水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。,（二）根据分子大小不同的分离方法：1、透析和超过滤：即利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质（如无机盐、单糖、水）等分开。,2、密度梯度（区带）离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度介质中离心时，每种蛋白质颗粒降到与自身密度相近的密度梯度时停止不前，各种蛋白质被分离成各自独立的区带。3、凝胶过滤（分子筛层析）根据分子大小来分离蛋白质混合物的最有效的方法之一。当分子大小不同的混和样品通过装填有高度水化的惰性多聚体（葡聚糖凝胶Sep

6、hadex和琼脂糖凝胶Sepharose）的层析柱时，比凝胶“网眼”大的蛋白质分子不能进入“网眼”而被排阻在凝胶颗粒之外，比“网眼”小的分子则进入凝胶颗粒的内部。这样，由于不同大小的分子所经历的路程不同而得以分离，大分子先洗下来，小分子后洗下来。,（三）根据电荷不同的分离方法：1、电泳 2、离子交换层析（四）根据特异亲和力不同的分离方法亲和层析,层析技术,层析又称色谱法：利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的形状和大小，分子的极性，吸附力，分子的亲和力，分子的分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相是固定的，称固定相；另一相是流动的，称流动相。当流动相流过固定相时，各组分

7、以不同的速度移动，而达到分离。,（1）吸附层析：利用吸附剂（固定相）表面对不同组分物理吸附性能的差异而达到分离的目的。如 硅胶G薄层层析。（2）分配层析：利用各组分在给定的两相中不同的分配系数而得到分离。如 纸层析。（3）离子交换层析：利用离子交换剂与试样中不同离子结合吸引力的差异大小不同而得到分离。常用的交换剂有CM纤维素（弱酸型阳离子交换剂）。弱碱型的有阴离子交换剂DEAE纤维素、改进型的CMSephadex和DEAESephadex。（4）凝胶层析：利用固定相的孔径对试剂样各分子（分子量大小或体积大小）的排阻特性差异进行分离。（5）亲和层析：利用固定相特定配体与试样各分子特异性结合力（亲

8、和力）大小不同进行分离。,电泳技术 电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。原理：在一定PH条件下，不同的物质具有不同的等电点就带不同性质的电荷，因而在电场中它们的移动方向和移动速度也不同，可使它们分离。颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的影响。,目前，电泳（electrophoresis）方法大致可分为三类：显微电泳、自由界面电泳（没有支持物）及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛。显微电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前已用于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。自由界面电泳是被分离的溶质颗粒经电泳后与缓冲溶液之间形成界面的电泳过程。利用适当的光学系统可观察到界面的移动。在电泳过程中，每个移动界面（峰）相当于某一特定的蛋白质。如：用于血浆蛋白成分的电泳。,蛋白质分离纯化及鉴定,分级沉淀法与等电点沉淀法联合使用得到初步分离,脱盐（透析和凝胶过滤）,离子交换层析或亲和层析进一步纯化,纯化,鉴定,含量的测定,Lowry法测蛋白含量,基本性质的测定,pH的测定（滴定法，等电聚集电泳）,Mw的测定（梯度密度离心，SDSPAGE）,纯度测定（比对多种电泳结果）,E学测定（反应速度，Km，影响因素）,序列测定,免疫学鉴定,