基因论文.docx

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1、基因论文表达载体和特殊用途的载体 摘要：目的基因能够有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，很大程度上取决于所采用的载体，载体的改进和新载体的构建是基因工程研究中十分重要的内容。表达载体和特殊用途的载体是在克隆载体的基础上不断发展起来的，其构建原理和构建步骤各有特点，随着载体的发展，表达载体和特殊用途的载体发挥着越来越大的作用。 关键词：表达载体 特殊用途的载体 构建原理 构建步骤 应用 1 表达载体 1.1 表达载体的概念 表达载体是可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。一般在克隆载体基础上增加了基因表达的调控元件。表达载体的类型很多可分为质粒表达载体、病毒表达载体、人

2、工染色体和可转移表达载体等类型。每种类型中的不同载体又有其不同的适用宿主。 1.2表达载体构建原理 1.21 质粒表达载体构建原理和步骤 质粒表达载体组成：在以质粒为基本骨架的克隆载体的基础上，组装启动子、转录终止子和核糖体结合位点等表达元件而构建成的。质粒表达载体又可以分为原核表达载体和酵母表达载体。 1.211 原核表达载体构建原理和步骤 首先，原核表达载体的表达元件主要包括启动子、转录终止子和核糖体结合位点。其中，启动子主要有lac，trp，tac，T7噬菌体启动子和1PL启动子。 根据其表达方式，可分为组成型表达，诱导型表达，融合型表达，分泌型表达。 原核表达载体构建原理： 1.获得目

3、的基因 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物，PCR循环获得所需基因片段。通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 2 构建重组表达载体 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 3 获得含重组表达质粒的表达菌种 将连接产物转化大肠杆菌，根据重组载体的标志作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进

4、入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点, 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 典型的原核表达载体：pGEX-4T-1是pGEX系列载体之一，由pBR322基本骨架改造而来，带ampr，在启动子tac和多克隆位点之间加入2个与表达蛋白分离纯化和检测有关的序列，其一是GST：其二是凝血蛋白酶切割位点的编码序列，当外源基因插入后，可在大肠杆菌BL21菌株中表达，产生融合蛋白。 pGEX-4T-1 原核表达载体 1.212 酵母表达载体构建原理和步骤 由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等翻译后修饰反应机制的差异，真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋白。酵母成为真核表达的首选系统。