毛细管电泳课件.ppt

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1、3.10.1 概述,1.电泳：在外加电场的影响下，带电的胶体粒子或离子在介质中作定向移动的现象称为电泳。2.不同带电粒子的电荷量和分子大小不同，流动速率也不同，因此电泳是一种适用于胶体粒子和离子的分析分离技术。,电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。,原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳

2、。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,电泳的分类,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,淀粉凝胶电泳：多用于

3、同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质,另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。,电泳技术的特点,凡是带电物质均可应用某一

4、电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高;特别适合于蛋白、核酸等大分子物质的分离。是生化药物、基因工程药物分析的重要手段。,毛细管电泳（CE）,毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管电分离法（CESM），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液体分离分析技术。毛细管电泳实际上包括电泳、色谱及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入到纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析称为可能。,高效毛细管电泳（HPCE）,高效毛细管电泳（HPCE）是近年来发展起来

5、的一种高效、快速的分离分析技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。HPCE已成为一种重要的分离分析方法，在生物、医药、化工、环保、食品等领域具有广阔的应用前景。,3.10.2 高效毛细管电泳的理论基础,1.经典电泳与高效毛细管电泳区别（1）经典电泳分离法的不足所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。（2）高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又

6、可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,2.电泳现象与电渗流现象,电泳：在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称为电泳。电渗流（electro osmotic flow，EOF）：指管内溶液在外力电场作用下整体向一个方向运动的现象。,HPCE通常采用的是石英毛细管柱，一般情况下（pH3），硅醇基（SiOH）电离为硅氧基负离子（SiO），使管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合离子（一般为阳离子）被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加高电压时，双电层中的阳离子

7、向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中溶液整体向阴极移动，产生电渗流。在不少情况下，电渗流的速度是电泳流速度的57倍。,3.分离过程,电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,正离子的运动方向和电渗流一致，因此最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，其移动速度相当

8、于电渗流速度；而负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，因而各种粒子因差速迁移而分离。分离方式的优点：所有正负离子和中性分子都向同一个方向迁移，因此可在柱末端放置检测器实现在线检测。,4.分离方程,粒子的电泳速率由下式决定：其中E为电场强度，ep为两溶质的平均电泳淌度，即离子在给定介质中单位时间和单位场强下移动的距离，淌度的大小与粒子的净电荷、半径及介质黏度等相关。,溶液中同时存在泳流和渗流，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内电解质中的运动速度应当是电泳流速度（）和电渗流速度（）的矢量和，即 式中，eo为电渗淌度，V为外加电压，L为

9、毛细管总长度。,理论塔板数n为：式中D为扩散系数，分离度R为1，2分别为相邻两溶质的电泳淌度，ep为两溶质的平均电泳淌度。,在HPCE中电渗流的一个重要特点是具有平面流型，电渗的驱动力沿毛细管均匀分布，它使整个流体象一个塞子一样以均匀的速度向前运动。而在HPLC中流体流型则是抛物线型的层流，其中心处速度是平均速度的2倍。电渗流的平面流型和HPLC中高压泵驱动所产生的抛物线型层流的速度曲线不同，不会直接引起样品组分区带在柱内扩张，这是HPCE获得高效分离的重要原因之一。,5.HPCE的特点,优点：1.高灵敏度：采用电化学检测器，最低检测限可达10-19 mol；2.高效：HPCE每米理论塔板数为

10、几十万，高者可达几百万甚至几千万；3.高速：通常的分析时间不超过30 min。有1.7 min内分离19种阳离子及3 min内分离30种阴离子的报道；4.样品用量少：只需nL（109 L）级；5.低消耗：每次分析只需少量（几毫升）流动相，分析过程是在价格低廉的毛细管柱中进行；6.应用范围广：从简单的无机离子、有机离子到整个细胞，都可进行分离分析。具有“万能”分析功能或潜力。不足之处：进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。,6.影响柱效的因素及改进方法,热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的

11、方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。,电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。,使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。,3.10.3 高效毛细管电泳仪器,电压：030KV。分离柱不涂敷任何固定液，紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：10-1910-21 mol/L）,毛细管的特点,检测器,由于HPCE采用了极小内径的毛细管，进样量很小，因此只有具有高灵敏度的检测器，才能进行定性、定量分析。检测

12、器是HPCE仪的关键部件。HPCE检测器中应用较广泛的是紫外-可见检测器和电化学检测器。迄今为止，除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱（ICP）及红外光谱未用于HPCE外，荧光、电化学、质谱、激光类和其他类型检测器（如折射率检测器、同位素检测器等）均已应用。,3.10.4 高效毛细管电泳的分离模式,1.毛细管区带电泳(CZE)2.毛细管凝胶电泳(CZE)3.胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）4.毛细管等电聚焦(CIEF)5.毛细管等速电泳（CITP）6.毛细管电渗色谱,1.毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis，CZE,带电粒子的迁移速度=电泳和

13、电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；,阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；,2.毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis，CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好

14、分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。,1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,3.胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,2.电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,5.色谱与电泳分离模式的结合。,3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分

15、与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,4.毛细管等电聚焦 capillary isoelectric focusing，CIEF,4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时

16、，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,5.毛细管等速电泳 capillary isotachophoresis，CITP,3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=

17、E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；,capillary isotachophoresis，CITP,(1)在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程.(2)这种方式将HPLC发展的固定相引入到CE中，增加了选择性，但又保持了CE的固有优点，是一种有发展前景的分离模式。,6.毛细管电渗色谱 capill

18、ary electroosmostic chromatography，CEC,3.10.5 应用与进展,1.离子分析2.药物分析3.手性化合物分析4.氨基酸与蛋白质分析5.核酸分析及DNA排序6.新进展,1.离子分析 analysis of ion,阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电

19、渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；,2.药物分析 analysis of pharmaceutics,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；,采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法,3.手性化合物分析 analysis of chiral compounds,合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；H

20、PCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,4.氨基酸与蛋白质分析 analysis of amino acids,采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；,蛋白质分析,5.核酸分析及DNA排序 analysis of nucleic acids and sequence of DNA,重要分析手段；图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,6.新进展advances and special topics,1.微型化 整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2.联用仪器 CE-MS；3.阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序；510万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1200碱基对/小时，提高速度！100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支,