药品质量控制中的现代分析方法与技术课件.ppt

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1、第二十一章 药品质量控制中的现代分析方法的进展,现代分析方法与技术，为药学的发展提供了适时而有效的辅佐与动力。,色谱及其联用技术：药学研究分子水平。手性分析：毛细管电泳及手性色谱技术药物研究与质量控制提供了保障。现代光谱技术：药物结构鉴定，微量杂质检定。,概况,一、定义 电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）以此对物质进行分离分析的方法即电泳法,第一节 毛细管电泳及其应用,二、发展简史 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但毛细管电泳技术最早是由瑞典科学家Hjerten 提出的，其广泛应用，则

2、是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。国内最早是由竺安教授在1980年提出来的，他先后在中国科学院化学研究所和浙江大学建立了两个研究组。1992年CE开始受到国内广泛重视，发展很快。,三.毛细管电泳的优点,1、高灵敏度2、高分辨3、速度快4、进样少5、成本低,高灵敏度：紫外检测器的检测极限在10-1310-15mol之间，荧光检测可达10-1910-21mol,高分辨：峰分离效率超过1百万理论塔板数，一般可达几十万。,速度快：许多分析在几秒至30分钟内完成。,进样少：

3、一般需要毫微升的进样量。,成本低：一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液。,分离模式：（一）毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis，CZE,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；,阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；,1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,（二

4、）胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,2.电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,5.色谱与电泳分离模式的结合。,3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,（三）毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis,CGE)（四）毛细管等速电泳（capillary isotachor-pho

5、resis,CITP)（五）毛细管等电聚焦电泳（capillary isoelectric focusing,CIEF)（六）毛细管电色谱（capillary electrochromatography,CEC)（七）微芯片毛细管电泳（microchip electrophoresis),应用与进展,毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序列分析和DNA合成中产物纯度测定等,1、离子分析 analy

6、sis of ion,阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；,2、药物分析 analysis of pharmaceutics,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；,采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法,3、手性化合物分析 analysis of chiral compounds,HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍

7、生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,4、氨基酸与蛋白质分析 analysis of amino acids,采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；,蛋白质分析,5、核酸分析及DNA排序 analysis of nucleic acids and sequence of DNA,重要分析手段；酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,CE和HGP,目前，人类基因测序已基本完成，人类基因组计划进入后基因组时代。但是，耗资巨大的HGP至少在现阶段并没有产生原先设想的

8、强大影响力。这是因为人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。,蛋白质,肽片段混合物,酶切,CZE,分离,特征性肽图,微量制备,CE,分别测定各片段的氨基酸序列,整个蛋白质的一级结构,CE应用举例-肽的分析,6、新进展advances and special topics,1）微型化 整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上

9、光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2）联用仪器 CE-MS；3）阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序；510万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1200碱基对/小时，提高速度！100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支,第二节 超高效液相色谱及其应用UPLC,超高效液相色谱的发展,站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联用时，也

10、提出了更高的要求。因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重新认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。,超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠以下几个方面的进步：（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现；（2）超高压输液泵的使用；（3）高速采样速度的灵敏检测器；,（4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配备了针内进样探头和压力辅助进样技术（5）仪器整体系统优化设计：色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。,分析速度快,灵敏度高,分离度好,超高效液相色谱的优点,

11、0.00,0.04,0.08,0.12,0.16,0.00,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00,3.50,4.00,4.50,5.00,5.50,6.00,1.Thiourea-0.430,2.toluene-1.034,3.propylbenzene-1.742,4.butylbenzene-2.413,5.hexylbenzene-5.058,样品的组份数：55m颗粒度完全分离时间：6.00分钟,0.20,0.24,UPLC,AU,0.00,0.10,0.20,Minutes,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45,

12、0.50,0.55,0.60,UPLC,HPLC,样品的组份数：51.7m颗粒度完全分离的时间：0.60分钟,UPLC的速度提高了！,增加了样品的通量,0.00,AU,使用1.7m颗粒度的填料增加灵敏度,可看到更多的样品信息,恒定柱长时；UPLC的灵敏度提高1.7倍（170%）！,恒定L/dp时；UPLC的灵敏度提高三倍（300%）！,Ultra Performance LC 速度、灵敏度与分离度的结合,AU,0.000,0.010,0.020,0.030,0.040,0.050,Minutes,0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00,7.00,AU,0.000,

13、0.010,0.020,0.030,0.040,0.050,Minutes,0.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00,12.00,15.00,60%更快30%更灵敏70%更高分离度,在改进获得信息质量的前提下提高分析速度,Ultra Performance LC 速度、灵敏度与分离度的结合,HPLC3.5m,UPLC1.7m,对流出时间接近的色谱峰有更好的分离度及更高的灵敏度,生产力：每次实验得到更多信息,AU,AU,2.理论基础,在高效液相色谱速率理论中，Van Deemter方程式的简化表达式：如果仅考虑固定相的粒度 对 的影响，其简化方程式可表达为：,van Deem

14、ter 曲线带来的承诺,如果填料的颗粒继续演变,更小的颗粒度,填料颗粒尺寸的演变,前景：2.1100mm色谱柱1.7m杂化填料颗粒可达到15,000psi通常有每米200,000理论塔板数的柱效,速度、灵敏度及分离度的完美结合,3.UPLC仪器介绍,检测器：光学及/或质谱检测器 可调紫外或光电二极管矩阵；为UPLC专门优化的流动池；高速检测,色谱柱管理：创新的枢轴转动设计 置色谱柱出口直接到检测器,样品管理器：低扩散XYZZ形式 快速进样周期 低交叉污染 样品盘及/或样品瓶 可选样品组织器,两元溶剂管理：高压混合 两元梯度 四溶剂选择 在线脱气 低扩散设计 UPLC的耐压能力,3.1 超高效液

15、相色谱的C18色谱柱,固定相粒度直径可达1.7m色谱柱长可达3-5cm,3.1.1 色谱柱颗粒化学,在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的1.7m颗粒三官能团键合C18配体,改善了高pH稳定性改善了硅胶的柱效和反压改善了低pH稳定性,3.1.2 色谱柱硬件,筛板、柱管和连接件，可在超过140MPa压力下装填，保证色谱柱高柱效和长寿命。,可记录进样次数、最大反压及温度智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历史文件信息不可删除含有该色谱柱独特的分析证书,eCord 装置,3.2 超高效液相色谱的输液系统,3.2.1 二元溶剂管理系统,高压混合二元梯度四溶剂选择在线脱气低扩散设计耐高压,3.2.2 UPLC超

16、高压输液泵的特性,与普通HPLC的高压梯度系统相比，UPLC的梯度性能极佳,当梯度陡度为1%，梯度范围为90%-100%时，超高压输液泵的梯度运行曲线,UPLC的重现性,UPLC 34次进样分析烷基芳酮混合物保留时间的重现性,其精确度、可靠的梯度性能与HPLC的重现性不相上下,UPLC的耐受性,稳定性试验的条件：从10到90%甲醇的1分钟梯度1000次进样温度：55C最大压力：8500psi流速：1.3ml/min.,ACQUITY UPLC C18 色谱柱2.130mm 1.7m黑色：第一次进样红色：第1000次进样,3.3 超高效液相色谱的高速检测器,UPLC光导检测器流通池示意图,采样速

17、度快能减少谱带扩展以保持柱效灵敏度比HPLC提高2-3倍,流通池体积小、池壁全折射而不损失光能量,3.4超高效液相色谱的自动进样器,针内针装置,外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可达到微量取样（L取样）,减少死体积，降低谱带扩展快速自动取样低扩散、低交叉污染,4.1 超高效液相色谱的应用,药物分析 如天然产物中复杂组分的分析 生化分析 如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品食品分析 如食品中农药残留的检测环境分析 如水中微囊藻毒素的检测其他 如化妆品中违禁品的检测,高分辨串联质谱QTOF micro,灵敏度高(pg-fg级)和选择性强得到的质谱谱图数据完整、品质高。因而，在天然产物，新药开

18、发，药代研究和蛋白质组学领域的定性、定量分析研究方面占有重要地位。,从HPLC-MS到UPLC-MS 灵敏度明显提高,Ultra Performance LC 先进的MS入口技术 代谢物ID,HPLC,UPLC,4.2 超高效液相色谱的展望,UPLC可以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，为用户节省宝贵的时间和日常溶剂消耗，从而获得最大的投资回报。UPLC的高分离度可从容面对复杂组份（如蛋白质与代谢组学等生化领域、天然产物）分离的挑战。UPLC的高灵敏度可检测更加痕量的目标化合物。UPLC的快速分析大量样品，实现高通量。,第三节 手性高效液相色谱技术与应用,一 手性药物拆分机理 为了

19、使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是“三点手性识别模式”。,Thalidomide Event,美国食品与药品管理局（FDA）在1992年颁布了手性药物指导原则，要求所有在美国上市的外消旋新药，其生产者均需说明药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。,手性药物对映体的药效学差异1.治疗作用完全依赖一种异构体 如：S(-)-甲基多巴2.药理作用差别不大 如：异丙嗪3.药理作用类似，但反应强度有差别4.药理与毒理作用存在“质”的区别,手

20、性药物对映体的药动学差异 1.吸收 2.蛋白结合 3.代谢,手性药物的现状,手性药物（579）,药物（1992）,天然和半合成药物（556）,合成药物（1436）,非手性药物（857）,单一异构体（73）,外消旋体（506）,手性药物（547）,非手性药物（9）,单一异构体（537）,外消旋体（10）,Increasing 8%per year$200 billion 2008(projected),2004年全世界销售总额名列前20的药物,在20种药物中手性单一对映体药物有10种,手性药物对映体分离的方法,（1）生物转化不对称催化法（2）液-液萃取法（3）传感器法（4）渗透膜法（5）重结晶法

21、（6）色谱法：手性衍生化法（CDR）手性流动相添加剂法（CMPA）手性固定相法（CSP）,1柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。,2.手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂,3.手性固定相拆分法：将手性选择剂固着于多种基质上而制成手性固定相。

22、迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。,给体受体:如Pirkle型CSP，纤维素衍生物类:CDMPC主客体络合:如环糊精、冠醚类CSP手性配体交换色谱蛋白质类,(S,S)-Whelk-O-1,(R,R)-DNB-DPEDA,Pirkle型CSP手性识别机理：“三点作用模式”,chiral target or chiral stationary phase,纤维素衍生物类CSP,纤维素是D(+)-葡萄糖单元由1,4-糖苷键形成的高度有序、呈螺旋型空穴结构的光学活性天然高分

23、子,纤维素三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC,Chiracel OD）,Okamoto：510（62%）,几种常见的纤维素衍生物,（三）应用1对某些手性药物进行对映体的纯度检查；2生物体液中药物对映体的分离分析研究可探 索血药浓度与临床疗效的关系；3在研制手性药物过程中，可分别评价单个对 映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；4必要时，可进行手性药物对映体的制备分离（或拆分）。,示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯色谱条件：色谱柱NOVA-Pack C18（150mm3.9mm）流动相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾（pH2

24、.8）（5149）该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离分析。,示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）色谱条件：色谱柱：Zorbax ODS（250mm4.6mm），流动相：含有0.15%L-苯丙氨酸及0.11%硫酸铜（CuSO45H2O）水溶液（以0.05mol/L硫酸调pH至3.0）-甲醇（91）（流动相中L-苯丙氨酸及硫酸铜浓度分别为0.008mol/L和0.004mol/L）。流动相中L-苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫酸铜为二价金属螯离子，L-苯丙氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到色氨酸对映

25、体，共同形成配位络合物对，然后在反相柱上拆分。,示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）色谱条件：色谱柱 Chirex 3005手性色谱柱（R）-1-萘基甘氨酸和3，5-二硝基 苯甲酸以共价键结合流动相 正己烷-二氯乙烷-甲醇该法的拆分机理为“三点手性识别模式”。,甲硫氨酸 对羟基苯甘氨酸,TE CSP,TE CSP,MP-TE CSP,MP-TE CSP,PCl-TE CSP,PCl-TECSP,第四节 GC-MS和LC-MS 技术与应用,色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便

26、。色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。,GC-MS(gas chromatogram mass spectrum),测试流程,GC部分MS部分接口部分数据处理系统,联用仪内部结构,接口：协调联用仪器输出和输入状态的硬件设备,分类直接接口(小内径毛细管柱)开口分流接口(大内径毛细管柱)作用 降低压力 除去载气 传输组分,1毛细管柱;2内套管;3接MS的限流毛细管;4尾吹气入口;5尾吹气出口,谱图类型,色谱图,质谱图,Total Ion 色谱图,Mass 色谱图,Select Ion 监测图,Full S

27、can质谱图,SIM质谱图,总离子流色谱图Total ion current chromatogram,TIC 在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC图.质量色谱图Mass chromatogram 在一次扫描中，只记录某原子质量单位(m/z)的离子流强度随时间变化所得的色谱图 质谱 GC-MS能给出总离子流色谱图上每一个色谱峰的质谱图,色谱图比较,Mass Chromatogram,Total Ion Chromatogram,应用：1.生命科学、生物技术中应用2.药物分析研究中应用3.环境分析研究中应用4.食品安全分析研究中应用5.石油化工分析研究中应用

28、6.疾病预防控制中应用7.法庭科学中应用,液质联用与气质联用的区别:,气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。,现代有机和生物质谱进展,在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以下的小分子化合物。20世纪70

29、年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达15002000Da的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）应运而生。,目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。前者常采用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者常

30、用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。,LC-MS中的接口技术,电喷雾接口大气压化学电离,电喷雾（ESI）的特点,通常小分子得到M+H+,M+Na+或M-H-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。电喷雾电离

31、是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。,大气压化学电离（APCI）特点,大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。,正负离子模式:,一般的商品仪器中,ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。根据样品的性质选择，也可两种模式同时进行,LC-MS分析条件的选择和优化,1.接口的选择

32、：ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。,2.正、负离子模式的选择：,选择的一般原则为：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。,3.流动相的选择,常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸

33、铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。LCMS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸铵10一5 mmol/l。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。,4.流量和色谱柱的选择,不加热ESI的最佳流速是150ulmin，应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm内径的微柱，TIS源最高允许lmlmin，建议使用200400ulmin APCI的最佳流速lmlmin，常规的直径

34、4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用100mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。,5.辅助气体流量和温度的选择,雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。,化合物鉴别,全扫描方式（

35、Q1扫描）全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子，从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。子离子分析（MS/MS）用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（MRM）。子离子谱图与锥体电压断裂谱图（源内CID）可能十分相似，所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。,LC-MS技术的应用,以大气压电离为接口的LC-MS技术已经在药物、化工、临床医学、分子生物学等许多领域中获得广泛的应用,医药学

36、：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析 生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖 环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析 临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸 食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物 法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测 兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体 合成化学：有机金属化合物、有机合成物 有机化学：表面活性剂、染料,药物代谢研究,药物代谢与药物动力学研究技术上的最新重大进展是LC-MS-MS的使用，电喷雾（ESI）和大气压化学电离（APCI）以及大气压光电离（APPI）是其主要的离子源，由于具有高灵敏度（ng/mlpg

37、/ml），高选择性（检测特定的碎片离子）、高效率（每天可检测几百个生物样品和对药物结构的广泛适用性，对液态样品和混合样品的分离能力高，可通过二级离子碎片寻找原型药物并推导其结构，LC-ESI-MS-MS已广泛地应用于药物代谢研究中一期生物转化反应和二期结合反应产物的鉴定、复杂生物样品的自动化分析以及代谢物结构阐述等，已在世界上大型制药企业中取代HPLC而占据了主导地位，其测试的样品量占总量的70%以上。,天然产物天然药物的研究,目前中药开发研究有两条途径。一条途径是从单一植物中提取一种有效成分(单体化合物)或提取物开发成新药。另一途径则是中药复方制剂的开发研究。采用现代多种仪器联用新技术，特别

38、是高效液相色谱/质谱/质谱联用(HPLC-MS/MS)，可对其十几种乃至几十种化学成分进行指纹图谱分离鉴定。再从指纹图谱中选择四、五种指标成分(有效成分或特征成分)进行定量，可以确定出简化的指纹图谱和指标成分，又是最合理的中药复方质量控制的方法，是研究中药复杂体系，尤其是复方的有力工具。国内外很多学者已进行了复方丹参、清开灵、泻心汤、人参或党参制剂等中药中的主要成分的分析。,临床诊断和疾病生物标志物的分析,欧美等目前已广泛采用HPLC/MS/MS法用于临床诊断以及疾病生物标志物的研究、检测，具有专一性好、灵敏度高、成本低、分析快速，经济效益可观等特点。目前可进行新生儿遗传疾病筛选（PKU、MC

39、AD等四十种左右）、新生儿性激素变异的检测、男女激素的监测、老年痴呆症的早期诊断、抗排异药物的检测、磷酸脂的检测、血红蛋白变异检测、糖化血红蛋白（糖尿病早期检测）、某些心脏病、癌症疾病筛查如乳腺癌等等（Biomarker法、通过鉴定DNA损伤程度测定）、药物剂量监测、药物相互作用监测、地区性突发性中毒病人的毒物检测等。,残留、法医学和环境样品测定,中国入世后，食品工业最大的问题就是安全壁垒，这将给中国的进出口和国内企业带来极大的威胁。美国食品与药品管理局(FDA)、欧盟、日本、韩国等主要贸易国和地区公布了在进口动物源性食品中禁止使用的药物名单，提高了最高限量标准。这就要求中国加强农、畜、水产品

40、中的农药、兽药等残留的控制和检测。同样随着人类对生存环境的倍加关注，要求对环境中各种污染物、有害或有毒物以及法庭科学中毒物、滥用药物等进行更加严格的监控。而配以ESI、APCI和APPI离子化技术的LC/MS/MS以分析速度快、灵敏度高、特异性好等特点广泛应用与残留和毒物分析。目前已成功地进行数百种农药、兽药、抗生素、兴奋剂类残留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺类、硝基呋喃类、毒品、多环芳烃等等化合物的检测。,高效液相色谱电喷雾串联质谱法测定清开灵复方中胆酸,采用HPLC/MS/MS技术，从清开灵注射液中，通过分子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸。直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用电喷雾（ESI）离子源，在负离子扫描方式下，得到一极质谱图、即分子离子峰M-H-，再用二级质谱（MS/MS）扫描目标分子离子的碎片峰。再以相同的实验条件对标准品进行测定，做出其一级、二级质谱图。,通过对样品进行分子离子峰的扫描发现M-H-的峰中有一个很强的407，根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究，其应该为一有机酸的负离子峰，并初步推断其为胆酸。（胆酸的分子量为408）。如图所示：通过对照样品(右)和标准品（左）的二级质谱图，发现其主要碎片峰均吻合较好。,第五节 LC-NMR联用技术,连续流动操作模式停流操作模式峰存贮操作模式,