仪器分析高效液相色谱法.docx

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1、仪器分析 高效液相色谱法第17章 HPLC法 17.1 内容提要 17.1.1 基本概念 高效液相色谱法在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。 高效液相色谱仪采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。 梯度洗脱用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。也称为梯度淋洗。 低压梯度又称外梯度，特点是先混合后加压

2、。它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。 高压梯度又称内梯度，特点是先加压后混合。它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。 两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。 柱外效应由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。 液固吸附色谱法以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸

3、附剂表面发生竞争吸附性。K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。 液液分配色谱法根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。分配系数较大的组分保留值也较大。 正相分配色谱法流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。 反相分配色谱法流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。 化学键合相利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。 化学键合相色谱法采用化学键合固定相的液相色谱方法。它分为正相和反相键合相色谱法。 离子交换色谱法以离子交换树脂为固定相，水溶液

4、为流动相，利用待测样品中各组分离子与离子交换树脂的亲和力的不同而进行分离分析的液相色谱分析法。 凝胶色谱法以多孔性凝胶类物质为固定相，以水溶液或有机溶剂为流动相，根据不同组分分子体积的大小进行分离分析的液相色谱分析法。也称为尺寸排阻色谱法。 17.1.2 基本内容 1. 高效液相色谱仪的组成 不论何种类型高效液相色谱仪，基本上分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。 (1)输液系统包括贮液罐、高压输液泵、梯度洗脱装置等。 (2)进样系统是将待分析样品引入色谱柱的装置，包括取样、进样两个功能。 (3)分离系统主要是指担负分离作用的色谱柱，它是色谱仪的心脏。对色谱柱的要求是柱效高

5、、选择性好、分析速度快等。 (4)检测系统中的检测器可分为通用型检测器(对样品和洗脱液总的物理化学性质有响应)和选择型检测器(仅对待分离组分的物理化学性质有响应)。 2. 高效液相色谱法的特点 分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广。 3. 高效液相色谱法几种分离模式的分离原理及其应用 高效液相色谱法按组分在两相间分离机理的不同主要可分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化学键合相色谱法，离子交换色谱法和凝胶色谱法(体积排阻色谱法)。各类型的分离原理以及应用如下： 模式 液固吸附色谱 分离原理 利用组分在固定相上的吸附能力不同而分离，采用非极性或弱极性流动相，保留值取决于官

6、能团的类型和数目 液液分配色谱 根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。分配系数较大的组分保留值也较大 正相键合相色谱 利用组分在极性键合固定相与弱极性或非极性流动相之间分配系数不同而分离，流动相极性增大，保留值降低 反相键合相色谱 采用非极性键合固定相和以水为底溶剂的极性流动相，利用非极性基团的疏水作用和极性基团在流动相中的二次化学平衡，如形成离子对、手性包络物、酸碱平衡等进行分离 离子交换色谱及离子色谱 组分离子与固定相平衡离子进行动态交换，根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的 凝胶色谱 以孔径一定的多孔凝胶为填充

7、剂，样品可分离极性较小的样品，若利用二次化学平衡，可分离离子、离子型化合物，包括强酸强碱 离子、离子型化合物或者在一定条件下可解离的化合物 高分子、生物大分分离中等极性化合物 应用 分离几何异构体，不同族化合物以及用于纯化制备 最适合同系物组分的分离 按照尺寸差异进行分离。小分子保留值大，子等 大分子保留值小。根据孔径尺寸范围不同，有一定的相对分子质量分离范围 4. 高效液相色谱法的应用和局限性 HPLC具有高压、高速率、高效率、高灵敏度等特点，广泛应用于卫生检验、环境保护、生命科学、农业、林业、水产科学和石油化工等领域，尤其适用于分离、分析不易挥发，热稳定性差的各种离子型化合物。例如，分离分

8、析氨基酸、蛋白质、维生素、生物碱、糖类、农药等，在几百万种化合物中，可分离分析约80%的有机化合物。而其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等相对分子质量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。其局限性主要体现在：HPLC使用多种溶剂作流动相成本高，易于引起环境污染；缺少GC中使用的通用型检测器等。 5. 高效液相色谱常用的检测器 (1)紫外吸收检测器 其最重要的特征是对流动相的脉冲和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱；主要缺点是对无紫外吸收的组分不响应，而对紫外吸收较大的溶剂如苯不能作流动相使用。 (2)光电二极管阵列检测器 可获得组分的三维图谱，以获得更多信息。 (3)示差折光检

9、测器 属于通用型检测器，应用较多，主要缺点是对温度变化特别敏感，且不适于梯度洗脱。 (4)荧光检测器 属于高灵敏度、高选择性检测器，仅对具有荧光特性的物质有响应，对流动相脉冲不敏感，常用于梯度洗脱。 6. 高效液相色谱固定相 液-固色谱固定相：可分为极性和非极性两大类。极性吸附剂为各种无机氧化物，如：硅胶、氧化铝等；非极性吸附剂最常见的是活性炭。 不同类型的有机化合物，在极性吸附剂上的保留顺序如下： 氟碳化合物饱和烃烯烃芳烃有机卤化物醚硝基化合物腈酯、酮、醛羟酸。 液-液色谱固定相：由两部分组成，一部分是作为载体的惰性颗粒，另一部分是涂在载体表面上的固定液。常用b,b-氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨

10、烷等。液-液色谱固定相不适合梯度洗脱。 化学键和固定相：常用非极性键合相有十八烷基键合相(ODS)、极性键合相有氨基键合相(强极性)、氰基键合相(中强极性)。 化学键合相的优点：使用过程不流失；化学性能稳定，在pH28的溶液中不变质；热稳定性好，一般在70以下稳定；载样量大；适合梯度洗脱。 7. 高效液相色谱流动相 液相色谱的流动相又称为淋洗液、洗脱液等。流动相的组成、极性改变可显著改变组分分离状况，故改变流动相的组成和极性是提高分离度的重要手段。亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，而疏水性固定液常采用亲水性流动相。按组成不同流动相可分为单组分(纯溶剂)和多组分，按

11、极性可分为极性、弱极性、非极性，按使用方式则有固定组成(恒定)洗脱和梯度洗脱。 常用作流动相的溶剂有：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水等。可根据分离要求选择合适的纯溶剂或混合溶剂。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，达到改进分离或调整出峰时间的效果。 8. 液相色谱流动相的选择 在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时，首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加，也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短，即梯度洗脱。 17.2 习题解答 1. 高效液相色谱仪一般分为几个部分？从

12、仪器构造、分离原理、应用范围等方面比较气相色谱与液相色谱的异同点。 仪器组成 HPLC 高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统 GC 气路系统、进样系统、分离系统、温控系统、检测系统、数据处理或记录系统 流动相 1.流动相可为离子型、极性、弱极性、非极性溶液，可与被分析样品产生相互作用，并能改善分离的选择性； 2.液体流动相动力黏度为10-3Pas,输送流动相压力高达220MPa 固定相 1.分离机理：依据吸附、分配、筛1.分离机理：依据吸附、分配两1.气体流动相为惰性气体，不与被分析的样品发生相互作用； 2.气体流动相动力黏度为10-5Pas,输送流动相压力仅为，0.10.5MPa 析、

13、离子交换、亲和等多种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类繁多 2.色谱柱：固定相粒度小，为 510m；填充柱内径为36mm，柱长1025cm，柱效为103104；毛细管柱内径为0.010.03mm，柱长510m，柱效为104105；柱温为常温 检测器 选择性检测器：UVD,PDAD, FD, ECD 通用型检测器：ELSD,RID 进样方式 应用范围 样品制成溶液 可分析低相对分子质量、低沸点样品；高沸点、中分子、高分子有机化合物(包括非极性、极性)；离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性的生物分子 注：柱效用单位柱长中的塔板数表示 种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类较多； 2.色谱

14、柱：固定相粒度大，为0.10.5mm；填充柱内径为14mm，柱长15m，柱效为102103；毛细管柱内径为0.10.3mm，柱长10100m，柱效为103104；柱温为常温400 选择性检测器：NPD,FPD,ECD 通用型检测器：TCD,FID(有机物) 样品需加热汽化或裂解 可分析低相对分子质量、低沸点有机化合物；永久性气体；配合程序升温可分析高沸点有机化合物；配合裂解技术可分析高聚物 2. 流动相为什么要预先脱气？ 常用的脱气方法有哪些？ 答：流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处：气泡进入检测器，引起光吸收或电信号的变化，基线突然跳动，干扰检测；溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流

15、动相或固定相发生化学反应；溶解气体还会引起某些样品的氧化降解，给分离和分析结果带来误差。因此，使用前必须进行脱气处理。常用的脱气法有以下几种：低压脱气法(电磁搅拌，水泵抽空，可同时加热或向溶剂吹氮气；自动在线脱气)，吹氦脱气法，超声波脱气法，加热回流法。 3. 高压输液泵应具备什么性能？ 答：它应具备：流量稳定，输出压力高，流量范围宽，耐酸、碱和缓冲液腐蚀，压力变动小，更换溶剂方便，空间小，易于清洗和更换溶剂以及具有梯度洗脱功能等。 4. 在HPLC中，对流动相的要求是什么？ 答：(1)与色谱柱不发生不可逆化学变化，保持柱效或柱子的保留值性质长期不变；(2)对待测样品有足够的溶解能力；(3)与

16、所用检测器相匹配；(4)黏度尽可能小，以获得高柱效；(5)价格便宜，毒性小，易于纯化。 5. 什么叫梯度洗脱？适用于哪些样品的分析？ 与程序升温有什么不同？ 答：梯度洗脱就是在分离过程中，让流动相的组成、极性、pH等按照一定程序连续变化，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰，使保留时间短、拥挤不堪、甚至重叠的组分，或保留时间过长而峰形扁平的组分获得良好分离的一种操作形式。梯度洗脱特别适合于样品中组分的分配比值范围很宽的复杂样品分析。梯度洗脱十分相似气相色谱的程序升温，两者的目的相同。不同的是程序升温是通过程序改变柱温，当流动相和固定相不变时，分配比的变化是通过温度变化引起的。而液相色谱是通过改

17、变流动相组成、极性、pH来达到改变分配的目的，一般柱温保持恒定。 6. 在液相色谱中，提高柱效的途径有哪些？其中最有效的途径是什么？ 答：液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。 在液相色谱中要减小谱带扩展，提高柱效，要减少填料颗粒直径，减小填料空穴深度，提高装填的均匀性，采用低黏度溶剂作流动相，流速尽可能低，同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线。 简答：即液相色谱中提高柱效的途径主要有： 1.提高柱内填料装填的均匀性； 2.改进固定相 减小粒度；选择薄壳型担体；选用低黏度的流动相；适当提高柱温。 其中减小粒度是最有效的途径。

18、7. 什么是化学键合固定相？它的突出优点是什么？ 答：化学键合相是利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而构成各种性能的固定相。它的特点如下：(1)固定相不易流失，柱的稳定性和寿命较高；(2)能耐受各种溶剂，可用于梯度洗脱；(3)表面较为均一，没有液坑，传质快，柱效高；(4)能键合不同基团以改变其选择性，例如，键合氰基、氨基等极性基团用于正像色谱法，键合离子交换基团用于离子色谱法，键合C2，C4，C6，C8，C18，C22烷基和苯基等非极性基团用于反相色谱法等。因此，它是HPLC较为理想的固定相。 8. 选择流动相时应注意什么？ 答：(1)尽量使用高纯度试剂作流动相

19、，防止微量杂质长期积累损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 (2)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失，酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 (3)试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀在柱中沉积。 (4)流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 9. 指出下列物质在正相色谱和反相色谱中的洗脱顺序： (1)正己烷，正己醇，苯 (2)乙酸乙酯，乙醚，硝基丁烷 答：正相键合相色谱是采用极性固定相、非极性或弱极性流动相的色谱方法。若固定相是非极性的而流动相是极性的，则该键合相色谱法称作反相键合相色谱法。根据几种物质的极性比较：正己醇苯正己烷；

20、乙酸乙酯硝基丁烷乙醚，则在正相键合相色谱的洗脱顺序是：(1)组：正己烷，苯，正己醇；(2)组：乙醚，硝基丁烷，乙酸乙酯。而反相色谱中这两组物质的洗脱顺序恰好相反。 10. 在一根正相分配柱上，当用体积比为1:1的氯仿和正己烷为流动相时，试样的保留时间是29.1min,不被保留组分的保留时间是1.05 min。试计算试样物质的容量因子k。 t-ttR29.1-1.05解：k=R0=26.7 t0t01.0511. 为何高效液相色谱法一般采用全多孔微粒型固定相？ 答：表面多孔型固定相的多孔层厚度小、孔浅、相对死体积小、出峰快、柱效高。但因为多孔层厚度小，柱容量小，最大允许进样量受限制。而全多孔微粒型固定相颗粒细，孔浅，因此传质速率快，柱效高。最大允许进样量比表面多孔型大5倍。因此，通常采用此类固定相。 12. 在硅胶柱上，用甲苯为流动相时，某物质的保留时间为28min，若改用CCl4或CHCl3为流动相，指出哪一种溶剂能减少该物质的保留时间？ 答：该体系为正相色谱体系。体系中流动相的极性越大，物质的保留时间越短。根据极性比较：CHCl3甲苯CCl4，所以采用CHCl3可以减少保留时间。