RNA的生物合成(1).docx

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1、RNA的生物合成第十四章 RNA的生物合成 l l RNA生物合成的两种方式： 转录：DNA指导的RNA合成，生物体内的主要合成方式。 RNA复制：RNA指导的RNA合成，常见于病毒。 RNA前体：转录产生的初级转录本，需经加工为成熟的RNA后才具有生物学活性与功能。 一、 转录的基本特点 1. 不对称转录：转录时，只以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，将遗传信息由DNA传递给RNA的现象。 1) RNA分子只有一条链可转录，模板链并不总是在同一单链上。 2) 每个基因的转录都受到相对独立的调控。 3) 模板链及反意链：指导RNA合成的DNA链，又称为负链。 4) 编码链及有意链：不作为转

2、录模板的另一条DNA链，又称为正链。 5) 有意链与反意链并非固定不变。 2. 转录的连续性 1) RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，从头连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。 2) 单顺反子：合成的RNA中只含一个基因的遗传信息。 3) 多顺反子：合成的RNA中含有几个基因遗传信息。 3. 转录的单向性：RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为35，而RNA链的合成方向为53。 4. 转录不需要引物 5. 有特定的起点和终点： 1) 启动子：RNA聚合酶特异识别、结合和开始转录的一段DNA序列。 2) 终止子：提供转录停

3、止信号的DNA序列，在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。 3) 转录单位：DNA链上从启动子到终止子为止的一段DNA序列。 4) 转录起点：与新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，此点通常用+1表示； 5) 上游：转录起点前面的序列，用负数表示； 6) 下游：转录起点后面的序列，用正数表示。 7) 操纵子：原核生物基因转录的功能单位，结构上包括调节基因、启动子、操作基因、多顺反子和终止子等功能区。 二、 转录的条件 1. 底物 四种脱氧核糖核苷酸，即ATP，GTP，CTP 和 UTP。 2. 模板 转录反应需要DNA作为模板，且不同的RNA聚合酶对DNA两股链以及不同的DNA

4、段落都有一定的选择性。 3. RNA聚合酶 1) RNA聚合酶的特点 l 可启动RNA的合成，不需引物； l 只以一条DNA链或其一段DNA为模板； l 碱基互补配对的原则：A与U，G与C配对； l 合成方向：5 3； l 合成是连续进行的； l 无校读功能； l 需要Mg2+或Mn2+离子； l 可与多种调节转录的蛋白因子相互作用。 2) 大肠杆菌RNA聚合酶 l 每个细胞中约有3000个RNA聚合酶分子； l 组成：全酶由2 个、w、5种亚基组成，椭圆球形，可结合约60个核苷酸； l 因子与其它部分的结合不紧密，它易于与2w分离； l 核心酶：没有亚基的酶，只催化RNA链的延长，对转录的起

5、始无作用； l 各亚基的功能： ：识别启动子并与其牢固结合； ：聚合作用的催化位点，催化形成磷酸二酯键； ：全酶或核心酶与DNA模板结合的部位； ：特异地识别启动子，起始转录； l RNA聚合酶的作用： 识别启动子：依赖于亚基，亚基参与转录的起始，并决定转录的方向。 与DNA结合并使之解旋、解链，另外还具有重新使DNA螺旋化作用。 催化RNA聚合反应，负责三种RNA合成。 核心酶与不同的亚基结合，识别不同的启动子。 3) 真核生物RNA聚合酶 l 三种RNA聚合酶：、。 l 每个酶分子有两个大亚基，还有10个左右小亚基。 l RNA聚合酶：位于核仁中，活性最显著，负责转录rRNA基因。 l R

6、NA聚合酶：负责合成tRNA和核内小RNAs，其活性可被高浓度的-鹅膏蕈碱所迅速抑制。 l RNA聚合酶：位于核浆中，负责hnRNA的合成，其活性可被低浓度的-鹅膏蕈碱所迅速抑制。 l 由814个亚基组成，分子质量为500KDa。 l l C末端结构域(CTD)：最大亚基的C末端具有7个氨基酸 的重复序列，含有多个Ser和Thr磷酸化位点。 4) 噬菌体RNA聚合酶 l 仅由一条多肽链组成； l 合成速度很快，在37时可达约200核苷酸/秒； l 噬菌体RNA聚合酶只能识别噬菌体本身所具有的启动子，不能识别其他启动子。 l 线粒体和叶绿体中的RNA聚合酶 l 和细胞核中的酶完全不同，分子较小。

7、 l 类似于噬菌体RNA聚合酶。 5) 常用的转录抑制剂 4. 启动子 1) 原核生物启动子 l 在基因表达调控中，转录起始是关键，基因能否表达决定于在特定启动子的起始过程。 l 不同启动子对RNA聚合酶的亲和力各不同，对转录起始频率有重要的调控作用。 l 启动子的共同顺序：是启动子的关键部位，在RNA转录起点上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序 -35区：T85T83G81A61C69A52 -10区：T89A89T50A65A65T100 l -35序列：RNA聚合酶全酶的识别位点，对全酶有很高的亲和性，提供RNA聚合酶识别的信号。 l -10序列：又称TATA盒，是RNA聚合酶全

8、酶的紧密结合位点，有助于DNA局部双链的解开，决定着双链解开的速度和转录的方向。 l 两者共同决定了启动子的强度，也调控了转录的速度和RNA分子数。 l 上游顺序：起始位点上游50到150bp之间的顺序；是某些RNA聚合酶的激活蛋白的结合部位，也是拓扑异构酶的结合部位，这有利于转录起始的超螺旋状态的产生。 l 上游顺序所引起的DNA结构的微细变化，可在双螺旋上被传导到相当远的距离，影响到-10和-35区的DNA结构细节。 2) 真核生物启动子 l 真核生物三种RNA聚合酶都有各自的启动子。 l RNA聚合酶启动子：又称rRNA基因启动子或型启动子。 l 不同真核生物型启动子序列有较大的差异，缺

9、乏保守性，目前发现有两个区域是转录必需的。 l 核心启动子： -45至+20序列，富含GC序列，决定转录起始的精确位置。 l 上游控制元件： - 187至-107序列，富含GC序列，影响转录的频率。 l RNA聚合酶启动子：又称蛋白质基因启动子或型启动子。 l 核心启动子 TATA盒：位于 - 25 -35bp，基本上由AT组成，极少数启动子中有GC；共有序列为85A97T93A85A83；决定转录的方向和精确的起始位点。 起始子：与转录起点重叠的短的较保守序列，位于-3 +5，常有Py2CAPy5序列，其中A是mRNA中的第一个碱基；被转录因子TFD识别，与转录起始点的选择有关，影响启动子的

10、强度。 既无TATA框也无起始子的基因的转录速率通常很低，其起始点也不固定。 l 上游启动子元件：又称上游激活序列位于核心启动子上游，主要包括CAAT框和GC框，各自的保守序列与结合的蛋白因子各不相同，其功能是控制转录起始的频率。 CAAT框：位于上游-70 -80区，其保守序列为GGCCAATCT； GC框：位于-80 -110区，其保守序列为GGGGCGG，是转录因子的SP1结合位点。 l 远端调控区：某些基因的启动子远上游或下游区域可调节启动子的活性。 增强子：增强真核生物启动子活性的DNA顺序。长约100200bp，其核心组件常为812bp，可以单拷贝或多拷贝串联形式存在。 特点：增强

11、效应明显；可远距离调控； 增强作用与其序列方向无关；有组织和细胞特异性；无基因专一性；受外部信号调控。 沉默子：抑制基因表达活性的DNA序列，起与调控蛋白结合后可抑制转录起始复合物的活化；其作用不受距离和取向限制。 应答元件：真核细胞DNA上存在能对特定环境因素作出应答反应的DNA序列。能专一结合特异性蛋白因子，从而调控基因特异表达，如：糖皮质激素应答元件、金属应答元件、血清应答元件等。 上游元件的多样性：真核RNA 聚合酶II启动子包含着TATA盒、CAAT 盒、GC盒以及其他序列元件之间的不同组合，没有哪一种上游元件是所有启动子所共同必需的。 l RNA聚合酶启动子 分为三个亚类； 5S

12、rRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子，位于转录起始位点的下游，都由两部分组成； snRNA启动子由三个部分组成，位于转录起始位点上游。 5. 终止子 1) 原核生物终止子：在终止位点之前均有一个回文序列，由RNA形成发夹结构。 l 依赖因子的终止子：终止位点之前成发夹结构。 l 不依赖因子的终止子：称由为简单终止子，DNA模板链中有约6个串连A，转录RNA的3端为寡聚U。 l 2) 真核生物终止子：真核生物转录的终止信号和机制了解很少，其主要原因在于大多数RNA在转录后很快进行加工，难确定原初的3-端。 3) 加尾信号：DNA上AATAAA + 富含CA序列 三、 原核生物的转录 1.

13、转录的起始 1) 识别： l 全酶与DNA分子随机结合，形成松弛复合物； l 因子在DNA双链上寻找启动子：因子识别启动子的-35区，促使形成封闭复合物(双螺旋形式) ，并滑动到-10区； 2) 起始 l RNA聚合酶全酶促使局部双链解开，“关闭”复合体转变为“开放”复合体； l 催化ATP或GTP与另外一个三磷酸核苷聚合，形成第一个3,5-磷酸二酯键。 3) 延长：因子从全酶上脱离，核心酶继续沿DNA链移动，连续聚合RNA ；DNA的解链和重复螺旋化。 2. 转录的终止 1) 新RNA链脱落，DNA双链恢复，核心酶脱落后与因子结合。 2) 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子。

14、l 因子：六聚体蛋白质，亚基的分子量为50kD。该蛋白因子能识别终止信号，并能与RNA紧密结合，导致RNA的释放。 l nusA蛋白：分子量69kD的酸性蛋白，它能与RNA及RNA聚合酶相结合，在终止部位使两者被释放。 3) 依赖因子的终止：因子与聚合酶-DNA-RNA复合物结合，向3端移动，水解ATP解开DNA-RNA杂交体。 4) 依赖于特定序列的终止：转录的RNA形成发卡结构，阻止了转录向下游继续推进；由几个U和几个dA形成的RNA-DNA杂交双链很不稳定，于是新生RNA链很快自DNA双链中被排除出来。 3. 抗终止 1) 抗终止：又称通读，RNA聚合酶越过终止子继续转录的现象，通读是由

15、于终止子被特异性的因子抑制产生的。 l 抗终止因子：引起抗终止作用的蛋白质。 l 抗转录终止的主要方式：破坏终止位点RNA的茎环结构；依赖于蛋白质因子的转录抗终。 4. 转录的全过程 原核DNA和RNA生物合成的比较 四、 真核生物的转录 1. 转录因子 1) 反式作用因子：识别并作用于顺式作用元件的蛋白质因子，如转录因子。 2) 转录因子：RNA聚合酶在进行转录时所需要的一些辅助蛋白质因子。 l 通用转录因子：RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，与RNA 聚合酶在起始位点周围形成复合体，决定三种RNA转录的类别和起始的位置。 l 组织细胞特异性转录因子和可诱导性转录因子：这些TF是在

16、特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素、生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，3) 4) 5) 2. 1) 2) 3) 才需要的一类转录因子，如：热激因子。 l TBP： TATA 盒结合蛋白。 l 上游因子：识别并与启动子上游元件结合，与上游元件结合可增加转录起始的效率。 l TBP的作用机制：两个结构域形成一个完全二元对称的马鞍型结构，与DNA小沟有效结合； TBP 与DNA 结合，使DNA 弯曲了约80，TATA 盒向大沟弯曲，拓宽了小沟。 RNA Pol I 的通用转录因子 l 上游结合因子：可与UCE和核心元件的一段序列结合；两个UBF1通过蛋白蛋白相互作用而相互结合，导

17、致在两个结合位点间的DNA形成一个环状结构。 l 选择因子1 ：由4个亚基组成，TBP是保证RNA pol 准确结合到起始位点的一个关键因子，其他的三个亚基TAF 为TBP 相关因子。 RNA Pol 的通用转录因子 l tRNA基因的转录因子 TFC：识别boxB； TFB：由TBP、BRF、B”组成，与A框上游50kb上游序列结合，其功能是RNA聚合酶真正的起始因子。 l 5s rRNA转录因子，TFIIIA结合位点为 box C，TFIIIB，TFIIIC。 RNA pol II 的通用转录因子 l TF II A：含有至少3个亚基，与TFIID结合，稳定TFIID-DNA复合体；可能通

18、过解除TAFs的抑制而激活TBP。 l TF II B： 覆盖靠近起始点的启动位置，C端与TFIID和DNA的复合物结合，N-端与TFF协同作用募集RNA聚合酶II；TFIIB与TFIID结合，并为RNA聚合酶结合起一个桥梁作用。 l TF II D：为TBP+ TAFs， 结合在DNA小沟，识别和结合核心启动子。 l TF II F：结合Pol II并带向启动子；RAP74，参与DNA 双链的溶解；RAP30，与RNA 聚合酶紧密结合。 l TF II E： 扩大DNA覆盖区至+30。 l TF II H：有激酶活性， 使Pol II 的CTD 磷酸化，Pol离开启动子区。 真核生物基因转录

19、的过程 过程与原核生物的基本相同；起始时通用转录因子它们与RNA聚合酶共同组成转录起始复合物，转录在正确的位置上开始。 三种转录酶的起始有差异。 RNA 聚合酶 I 基因转录的起始 4) RNA 聚合酶 基因转录的起始 5) RNA 聚合酶 基因的转录过程 l 起始 首先TBP结合于TATA盒，然后TFA、 TFB、TFF、TFE、pol、TFH等依次结合在启动子处形成闭合复合物； TFH作用于起始子位置开始解螺旋形成开放复合物； TF II H：具有激酶活性，它将RNA聚合酶II 的CTD多个位点磷酸化，使起始复合物的构象改变，促进转录的起始阶段过渡进入延伸阶段。 l 延伸 延长反应开始后，

20、 TFE、 TFH 释放； 加入的延长因子与RNA聚合酶、 TFF形成延伸复合物，使RNA聚合酶的延长效率大大促进。 l 终止 RNA聚合酶的反应终止，RNA聚合酶脱磷酸化，并重新进入下一个循环，准备下一次转录的起始。 添加多聚A尾：内切酶在mRNA 3端poly添加位点的特定部位切开；poly合成酶催化多聚腺苷酸的反应合成poly尾。 3. 原核生物与真核生物转录的区别 五、 RNA转录产物的加工 1. 1) 2) 2. 1) 原核生物mRNA前体的加工 细菌中用于指导蛋白质合成的mRNA大多不需要加工，一经转录即可直接进行翻译。 也有少数多顺反子mRNA需通过核酸内切酶切成较小的单位，然后

21、再进行翻译。 原核生物rRNA的加工 原核生物rRNA基因结构 l rRNA的基因与某些tRNA的基因组成混合操纵子； 2) 3) 4) 5) 3. 1) 2) 3) 4) 4. 1) 2) 3) 4) 5) 6) 5. 1) 2) 3) l 它们在形成多顺反子转录物后，经断链成为rRNA和tRNA的前体，然后进一步加工成熟； l 大肠杆菌共有7个rRNA的转录单位，它们分散在基因组的各处。 转录产物通过链内互补序列间的碱基配对折叠形成一些茎环结构； 一些蛋白质与之结合形成核糖核蛋白复合体； 多数这样的蛋白质会保持与RNA的结合状态并成为核糖体的一部分； 结合完成后，开始RNA前体的加工： l

22、 特定碱基的甲基化； l 前体rRNA经过RNase III、RNaseP和RNaseF的切割释放出16S、23S和5S前体分子； l 切割下来的分子再经过核酸外切酶M16、M23、M5的修整而形成成熟的rRNA。 原核生物前体tRNA的加工 tRNA基因的转录单元大多数为多基因，同种tRNA或不同种tRNA的多拷贝组成一个转录单位，转录在一条RNA中。 tRNA与rRNA组成转录单位。 型tRNA有3-CCA-OH，型tRNA无 3-CCA-OH。 加工过程 l 转录物前体经过折叠形成特征性茎环结构； l 核酸内切酶E/F在3端切除一个侧翼序列，在前体3端留下一个额外的9核苷酸序列，然后外切

23、酶RNase D依次切去3端的7个核苷酸； l 接着RNase P切去5端侧翼序列产生出成熟的5端； l 随后，RNase D再除去3端剩余的两个核苷酸，产生出成熟的3端。 l 最后tRNA一系列碱基修饰。 真核生物tRNA的加工 断裂基因：真核基因常常是不连续的，其编码区被非编码区打断。 转录时外显子和内含子都能被转录，形成前体RNA。 剪接：加工时，内含子被切除而外显子被连接在一起的过程。 真核生物初级转录产物中只含有一个tRNA序列。 前体tRNA带有一个16 nt的5端前导区，一个14 nt的内含子和3端两个额外的核苷酸。 加工：内切酶识别初生转录产物形成的特定茎环二级结构，并切去5端

24、的前导区和3端的2个额外核苷酸；tRNA核苷酸转移酶将5- CCA-3序列转移到新生的3末端形成的tRNA3端的CCA结构；内含子的切除和一系列碱基的修饰。 真核生物rRNA的加工 真核生物有4种rRNA，即5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA和 5S rRNA。 前三者的基因组成一个转录单位，产生45S的前体RNA；rRNA基因含有内含子，该序列在转录后被切除； rRNA前体的修饰与剪接过程 4) 内含子的切除：rRNA基因内含子自身作为核酶起催化作用可进行自动剪接。 l 自我剪接的内含子必须折叠成精确的立体结构才能完成剪接反应。在体内，一些蛋白质因子与内含子结合，协助其保

25、持正确的立体结构。 l 转酯反应：由游离的鸟苷或鸟苷单、双、三磷酸化合物的3OH攻击5剪接位的磷酸酯键，将其断裂并使鸟嘌呤转移到内含子的5末端； l 转酯反应：前一外显子3末端的OH攻击剪接位的磷酸酯键使其断裂，将两个外显子连接，释放出内含子。 6. 真核生物mRNA前体的加工 1) 真核生物mRNA前体为hnRNA经过5端加帽、3端剪切及加多聚A尾、剪接、编辑等产生出成熟的mRNA分子。 2) 5端加帽 l 当前体mRNA从RNA聚合酶II中伸出其5端时即开始加帽反应。 l 第一步：RNA 5端的-磷酸基团由RNA三磷酸酯酶去除。 l 第二步：在鸟苷酸转移酶的作用下，RNA末端核苷酸的磷酸基

26、团亲核进攻GTP的磷酸基团，产生55对接的磷酸二酯键，同时释放出焦磷酸。 l 第三步：在鸟嘌呤甲基转移酶的作用下将一个甲基基团加到鸟嘌呤环的第7位N原子上，使鸟嘌呤转变成7甲基鸟嘌呤。 l mRNA 5加帽的功能：阻止mRNA的降解，作为进出细胞核的识别标记，提高mRNA的剪接效率及翻译效率。 3) 3端加尾 l 加尾信号：5-AAUAAA-3。加尾信号下游1030 nt处有一5-CA-3二联体，二联体的后面有一段富含GU的序列。 l 加尾：有多种蛋白质的参与切割和加尾两个性质不同的反应。 l 剪接 GUAG内含子：内含子的5端的两个核苷酸是GU，3端的两个核苷酸为AG。 型内含子的自我剪接

27、真菌、藻类、植物叶绿体和线粒体hnRNA中。 转酯反应：分支位点A的2OH进攻5剪接位点，使其断裂，同时这个A与内含子的第一个核苷酸形成2 ， 5 磷酸二酯键，内含子自身成环，形成套索结构。 转酯反应：上游外显子的3末端OH攻击3剪接位点的磷酸二酯键，促使其断裂，使上游外显子的50H和下游外显子的5磷酸基团连接，并释放出内含子，完成剪接过程。 被切除的内含子随后变成线性DNA，随即被降解。 hnRNA 的拼接 U snRNA：富含U的小RNA，含107至201 nt。 U1、U2、U3、U4、U5和U6 snRNA分别与蛋白质结合形成核内小核糖核蛋白，这些核蛋白与其他蛋白质因子一起按严格的程序

28、组装成剪接体，完成两步剪接反应。 剪接体：核小分子核糖核酸蛋白颗粒协同非核小分子核糖核酸蛋白因子先对剪接位点识别，再借助两者彼此间以及与mRNA前体的复杂相互作用，装配成的活性剪接复合物。 选择性剪接 真核生物基因经转录后，其初级转录产物在剪接过程中呈现出不同的方式。 有些基因的初级转录产物经剪接只产生一种成熟的mRNA。还有一些基因的初级转录产物经过不同的剪接途径，产生多种成熟的mRNA，继而产生功能不同的蛋白质。 可变剪接：一个mRNA前体经过不同方式的剪接产生相关但不同的成熟的mRNA的过程，又称选择性剪接。 顺式剪接：将同一RNA分子的内含子去除，使外显子连接在一起的剪接。 反式剪接：

29、以两种不同来源的RNA前体分子为底物，将不同RNA分子上的两个外显子剪接的过程。 RNA剪接的意义：RNA剪接是进化选择的结果，基因表达调控的重要方式。 l RNA编辑：修饰或轻微改变mRNA的核苷酸顺序，使它们与对应的模板DNA的顺序有所不同的过程。 通过位点特异性脱氨作用、插入或删除使原始转录产物核苷酸序列被更改。 RNA编辑的分子机制 RNA编辑的意义 拯救突变的危害，校正基因表达； 为在非编码区出现开放阅读框 提供可能，扩充了遗传信息，增加了基因产物的多样性； 与生物发育与分化有关，是基因调控的一种重要方式； 在理论上否定了通用密码子的例外现象； RNA编辑功能的发现有助于对核基因调控

30、线粒体基因表达的认识。 六、 RNA的复制 1. 2. 1) 2) 3) 4) 3. 1) 2) 3) RNA的复制：RNA病毒以自身RNA为模板合成与自身RNA完全相同RNA分子的过程。 RNA复制酶的催化性质 以四种NTP为底物； 专一性地选择病毒RNA为模板； 按5 3的方向合成病毒RNA； 无外切酶活性。 复制的过程 病毒RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成复制酶的亚基。 复制酶的亚基与来自宿主细胞的亚基s自动装配成RNA复制酶，进行RNA复制。 通常以分子中单链RNA为模板，复制出一条新的RNA链，然后以负链为模板复制出大量正链。 4. 最后再与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。