植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳课件.ppt

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1、在TEMED 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。在双功能交联剂如N，N-亚甲叉双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。,一、聚丙烯酰胺凝胶的本质,CH2=CH-C(O)-NH2(丙烯酰胺）CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2（N，N-亚甲双丙烯酰胺）,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sod

2、iumdodecylsulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。,在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示：,MW=K（10一）.(1)lgMW=lgK-bmR=K1-bmR(2)式中Mw为蛋白质的分子量，K、kl为常数，b为斜率,mR为相对迁移率.,测定某个蛋白质的分子量，只需比较它和一系列已知分子量的蛋白质在SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。后来，Weber等人基本按Shapiro的方法对约40种蛋白质进行了研究，进一步证实了这个方法地可行性。用这种方法测定蛋白质的分子量，简便、快速，只需要廉价的设备和微克量的

3、蛋白质样品；所得结果，在分子量为15,000200，000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在10%以内。因此，近几年来，SDS-凝胶电泳测定分子量的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。,为了阐明SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理，许多人进行了深入的研究。实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4克SDS/1克蛋白质。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，

4、它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。,在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意以下几个问题：1如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4克SDS/1克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：（1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。,（2）溶液中SDS的浓度：溶液中的SDS的总量，至少要比

5、蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。（3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。,2不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围Weber的实验指出，在5%的凝胶中，分子量25,000200,000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10.00070,000分子量的蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10,00050,000分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度

6、的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。,可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率）最好在0.20.8之间均匀分布。在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。,3有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽

7、链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。,4不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,

8、000。因此，在分析SDS-凝胶电泳所得的结果时，应该小心。一般至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。为了判断待测样品是否可用SDS-凝胶电泳法来测定分子量，也可以使蛋白质-SDS复合物在不同浓度（交联度相同）的SDS-凝胶中电泳。,如果待测样品的自由迁移率与标准蛋白质的迁移率基本交于一点，而且在不同浓度的SDS-凝胶中测得的分子量都相同，则表明此蛋白质在SDS-凝胶电泳中的行为是正常的，可以用SDS-凝胶电泳法测定其分子量。SDS-PAGE有连续体系及不连续体系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳的

9、方法1 器材与试剂：1.1.器材：夹心式垂直板电泳槽，凝胶模（1351001.5mm）（北京六一仪器厂）直流稳压电源（电压300600V，电流50100mA）吸量管（1,5,10 ml）烧杯（25,50,100 ml）细长头的滴管1ml注射器及6号长针头微量注射器（10l或50l）水泵或油泵真空干燥器培养皿（直径120mm）,1.2 试剂1.2.1 高分子量标准蛋白试剂盒（Pharmacia公司产品)5种标准蛋白质目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SDS-PAGE测定未知蛋白质分子量。,5种标准蛋白质,5种标准蛋白质,每种蛋白含量为40g。用时加入200l样品溶

10、解，经处理后，上样10l（2g）就能显示出清晰的条带。,1.2.2 低分子量标准蛋白试剂盒,自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择35种蛋白质，如马心细胞色素C（Mr12500）、牛胰胰凝乳蛋白原A（Mr25000）、猪胃胃蛋白酶（Mr35000）、鸡卵卵清蛋白（Mr43000）、牛血清白蛋白（Mr67000）等蛋白质，按照每种蛋白0.51mgml样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。,1.2.3 连续体系SDS-PAGE有关试剂 0.2molL-1pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠

11、(AR)Na2HPO42H2O 25.63g或Na2HPO412H2O 51.58g，再称取磷酸二氢钠(AR)NaH2PO4H2O7.73g或NaH2PO42H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容到1000ml。样品溶解液：0.01molpH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油或40%蔗糖及0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品。,连续体系样品溶解液配制,如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。,凝胶贮液：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶，4贮存可用12个月。凝胶缓冲液：称SDS0.2g，加0.2mol

12、L-1pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4贮存，用前，稍加温使SDS溶解。1%TEMED：取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4贮存。10%过硫酸铵（AP）：称AP1g，加重蒸水至100ml，此液应每周新配，置棕色瓶内，4贮存。电极缓冲液（0.1%SDS，0.1molL-1 pH7.2磷酸盐缓冲液）：称SDS 1g，加500ml0.2molL-1 pH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1000ml。,1.2.4不连续体系SDS-PAGE有关试剂,10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，

13、使其完全溶解。1%TEMED（V/V）：取1mLTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4贮存。10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01molL-1 pH8.0Tris-HCl缓冲液。先配制0.05molL-1 pH8.0Tris-HCl缓冲液：称Tris0.6g，加入50ml重蒸水，再中入约3ml1molL-1 HCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。,凝胶贮液 30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称Acr29.2g及Bis0.8g，溶于重蒸水中

14、，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。10%浓缩胶贮液：称Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。,凝胶缓冲液 分离胶缓冲液（3.0molL-1 pH8.9Tris-HCl缓冲液）：称Tris36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1molL-1HCl约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4贮存。浓缩胶缓冲液（0.5molL-1pH6.7Tris-HCl缓冲液）：称Tris 6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1molL-1HCl约48ml调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4贮存。电极缓冲液（

15、内含0.1%SDS，0.05molL-1Tris0.384molL-1甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。1%琼脂（糖）溶液：称琼脂（糖）1g，加电极缓冲液100ml，加热使其溶解，4贮存，备用。,1.2.5 不连续体系样品溶解液配制,如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。,2.配胶及凝胶板的制备,2.1配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法。,电极缓冲液为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，

16、内含0.1%SDS。,电极缓冲液为0.1molL-1pH7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS。,2.1.1 SDS连续体系凝胶配制,SDS-连续体系凝胶的制备：配制20ml所需浓度的分离胶，用细长头滴管将分离胶混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入样品槽模板。为防止渗漏，可在上、下电极槽中加入蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释，约30min，凝胶聚合，继续放置2030min后，倒去上、下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可进行预电泳或准备加样。,2.1.2 SDS-不连续体系凝胶的制备

17、 分离胶的制备：按表配制20ml10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约34mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。,浓缩胶的制备：配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，再放置2030min，使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3Tri

18、s-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。,3.样品的处理与加样3.1样品的处理根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，按51mg/1mL样品溶解液，溶解后，在100沸水浴中保温3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可入在20冰箱保存较长时间，使用前在100沸水中加热3min。,3.2、加样一个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为1020L（即210g蛋白）。如样品较稀，加样体积可达100L。如样品槽中有所泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸

19、入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。,3.3 电泳分离胶聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS连续系统预电泳采用30mA60120min。3.3.1连续系统在电极槽中倒入0.1%SDS pH7.2 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，将电流调至20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至50mA，待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边11.5cm处，停止电泳，一般需56h。,3.3.2不连续系统在电极槽中倒入pH8.3Tris-HC

20、l电级缓冲液，内含0.1%SDS即可进行电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏pH环境，如需要电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳后将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续SDS-PAGE。开始时电流为10mA左右，待样品进入分离胶后，改为2030mA，当染料前沿距硅橡胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源。,4.凝胶板剥离与固定电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液。,固定液取50%甲醇454ml

21、，冰乙酸46ml混匀。染色液称考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后应用。脱色液冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。,固定与染色,5.结果与分析5.1绘制标准曲线将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm）。以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。5.2根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。,6.

22、注意事项 6.1 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止引现象，所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡沫海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液34h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。6.2 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。,6.3 在不连续电泳体系中，预电泳只能在分

23、离胶聚合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。6.4 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或过低无可影响电泳效果。,6.5 SDS纯度：在SDS-PAGE中，需高纯度的SDS，市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20gSDS放在圆底烧瓶中，加300mL无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min，用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至20冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量20预冷的无水乙

24、醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40以下的烘箱中烘干。,6.6 用SDS处理蛋白质样品时，每次都会在沸水溶中保温35min，以免有亚稳聚合物存在。6.7 标准蛋白质的相对迁移率最好在0.20.8之间均匀分布。值得指出的是，每次测定未知物分子量时，都应同时用标准蛋白制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好，对糖蛋白，胶原蛋白等分子量测定差异较大。,6.8 对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。

25、如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以1015L为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。6.9 由于凝胶中含SDS，直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用25%异丙醇内含7%乙酸浸泡，并经常换液，直到SDS脱尽（约需23天才可制备干板。为方便起见，常采用照像法，保存照片。,蛋白质双向电泳,一、实验原理蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing,IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大

26、小进行分离。经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。等电聚焦是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳，其特点是在凝胶中加入一种两性电解质载体，从而使凝胶在电场中形成连续的pH梯度。蛋白质是典型的两性电解质分子，它在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向电场的正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。这种泳动只有在等于等电点的pH环境中才停止。如果在一种pH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，那么在电场作用下，不管这一群混杂的蛋白质分子原始分布如何，各蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度相对应的位置进行聚集经过一定时间后，不同的

27、蛋白质组分别分割在不同的区域之中。这个过程称作等电聚焦蛋白质聚集的部位蛋白质所带电荷为零，测定此部位的pH值，即可知该蛋白质的等电点。,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），主要用于测定蛋白质亚基分子量，SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂则能使半光氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有电荷的差异

28、。因此这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。蛋白质双向电泳是将蛋白质等电点和分子量两种特性结合起来进行蛋白质分离的技术，因而具有较高的分辨率和灵敏度，已成为蛋白质特别是复杂体系中的蛋白质检测和分析的一种强有力的生化手段。,二、实验器材和试剂1、凝胶原液（28.38%Acr+1.62%Bis）。2、TEMED原液。3、过硫酸铵。4、pH3.510、pH46、pH68两性电解质载体。5、尿素。6、10%非离子去污剂NP-40。7、50mmo

29、l/L NaOH；。8、25mmol/LH3PO4。9、SDS。,10、60mmolTris-Cl pH6.8。11、2-巯基乙醇。12、10倍SDS-PAGE电极缓冲液（0.25mol/L Tris-HCl,1.92mol/L 甘氨酸，1%SDS）。13、0.05%溴酚蓝。14、1%琼脂。15、蛋白质抽提液（30mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/LMgCl2,6mmol/L抗坏血酸，1%PVP，5%甘油，0.02%2-巯基乙醇）。16、丙酮。17、研钵，石英砂，烧杯，试管，玻棒，量筒。18、双向电泳槽一套（包括圆盘电泳槽和垂直板状电泳槽等），电泳仪。,三、实验方法1

30、、叶片可溶性蛋白质的制备：取叶片200mg加少许石英砂于液氮中研成粉末悬浮于3ml可溶性蛋白抽提液中，4放置1小时以上，于4，15000 r/min条件下离心15min，取上清按1：4与冷丙酮混合，-20放置3小时以上或过夜，同样离心取沉淀，用80%丙酮洗两次，同上离心，真空干燥，溶于400l（9.5mol/L尿素，5mmol/L K2CO3，1.25%SDS，0.5%2-巯基乙醇，2.2%两性电解质PH 3.510，6%TritonX-100）中，经离心取上清上样。,2、第一向等电聚焦电泳（IEF）2.1 玻管的准备：取内径1.52mm，长16cm玻管用乙醇/盐酸为6/4的溶液浸泡30min

31、再用蒸馏水冲洗，烘干。灌胶前用封口膜封住管的一端，并固定。2.2 凝胶的配制与电聚焦：取尿素2.06g，加入0.75ml蒸馏水，0.75ml 10%的NP-40，37水浴（不能超过37）待尿素充分溶解后加入0.5ml的凝胶原液和两性电解质0.05mlpH3.510、0.05ml pH46、0.15mlpH68，再加入10l 10%AP和3l TEMED，混匀后灌胶。在灌好的胶管的顶部覆盖1cm的双蒸水，室温聚合1小时以上，待胶聚合好后吸去上层水溶液加样30l，再加入20l样品覆盖液8mol/L尿素，1.5%两性电解质（0.3%pH3.510，0.3%pH46，0.9%pH68），5%NP-40

32、，5%2-巯基乙醇和50mmol/LNaOH至管口，待电泳。电极液为：上槽（负极）50mmol/LNaOH，下槽（正极）25mmol/LH3PO4，在室温下，按200V15min，300V20min，400V30min，500V30min，600V16h的程序进行聚焦。,2.3、取胶、pH梯度的测定及胶条的平衡聚焦结束后，取出玻管，吸去两端的溶液并以双蒸水清洗，然后用10ml注射器套上200l的tip头吸取一些水从进样的一端轻轻将胶条打出。将要测定的胶条按每段1cm分成若干段后，安顺序装入盛有脱气的双蒸水的小瓶中，放4冰箱过夜，次日用pH计分别测定各段的pH值。对要进行第二向SDS-PAGE的

33、胶条则必须放入平衡液60mmol/LTris-Cl pH6.8，2%SDS，5%2-巯基乙醇，10%甘油，0.05%溴酚蓝中平衡1030min（平衡后的胶条酸端染成淡绿色而碱端染成深蓝色）。暂不进行第二向电泳的胶条可放入-20保存数日。,2.4、第二向SDS-PAGE选用DDY-28D型（北京六一仪器厂生产）电泳槽（规格为2001301mm，双板），分离胶浓度13%，浓缩胶浓度5%，分离胶长160mm，浓缩胶长40mm（灌至玻板上沿），灌好浓缩胶后在一端插入单孔梳，以便加入蛋白质分子量标准品。待胶聚合后，将第一向平衡好的胶条平放于浓缩胶顶部（避免胶条拉伸）并用1%琼脂糖（用电极缓冲液配制）封胶

34、。此时应注意避免胶条与浓缩胶上沿之间产生气泡（可先用尖头滴管加热到70的琼脂糖在浓缩胶上沿薄薄地涂上一层，立即将平衡好的胶条平放于其上，再用注射器针头挑动胶条使其结合完好）。待琼脂糖凝固后拔出单孔梳，加入适量按变性胶处理过的marker，加满电极缓冲液，4冰箱电泳，恒压200V，至溴酚蓝达胶底部为止（约5h）。,2.5、染色与脱色2.5.1 考马斯亮蓝染色电泳结束后，剥下胶板，放入染色液（0.05%考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，10%甲酸40%水）中于室温2h，换脱色液（慢脱色液：7%乙酸；快脱色液：30%乙醇，10%乙酸），脱色至背景清晰。温度升高，染色或脱色速度相对加快。脱色好后的胶最

35、好立即照相，也可放入7%乙酸于4冰箱保存随时照相。,2.5.2 硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）（1）固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。（2）敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。（3）清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。（4）银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。（5）显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去离子水。（6）终止：5%的醋酸。（7）照相分析。（8）保存制作干胶。,结果举例】,3.注意事项样品

36、预处理是双向电泳的关键。等电聚焦电泳的样品中必须去除盐离子、色素、酚类和核酸等物质，还要加入防止蛋白质水解的抑制剂，所以根据不同样品需要查阅有关资料进行样品预处理。是否聚焦的好坏与两性电解质的质量也有关系。,4.双向电泳常见问题,1.重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。,2.跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 A/胶)？电流的平方和功率成正比。电流增大，功

37、率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。3.跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。,4.跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端

38、移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。5.跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。6.跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。,7.跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白

39、质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。8.重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。9.怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。,