无花果蛋白酶与木瓜蛋白酶酶学性质的比较.doc

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1、吉 林 大 学 学 报 ( 理 学 版)第 46卷 第 6期2008年 11月Vo l. 46 No. 6Nov 2008JOURNAL O F J IL IN UN IV ER S ITY ( SC IENCE ED IT ION )无花果蛋白酶与木瓜蛋白酶酶学性质的比较曲和之 , 黄露 , 张国华 , 柴智 , 张雷 , 郝东云 , 王晓平(吉林大学 分子酶学工程教育部重点实验室 , 长春 130021)摘要 : 比较了无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的部分酶学性质 , 二者均为巯基蛋白酶类 , 且水解底物相似 . 实验结果表明 , 无花果蛋白酶比木瓜蛋白酶的适用性更广 , 两者在反应温度范围 上

2、各有优点 , 无花果蛋白酶的适宜 pH 值范围大于木瓜蛋白酶的适宜 pH 值范围 ; 在对底物的亲合性上 , 无花果蛋白酶明显高于木瓜蛋白酶 .关键词 : 无花果蛋白酶 ; 木瓜蛋白酶 ; 酶学性质比较文章编号 : 1671 25489 ( 2008 ) 06 21217 204中图分类号 : Q554文献标识码 : AThe Com par ison of Enzyma tic Character istics of F ic in and Papa inQU H e2zh i, HUAN G L u, ZHAN G Guo2hua, CHA I Zh i,ZHAN G L e i, HAO

3、 Dong2yun, WAN G X iao2p ing( Key L abora tory of M olecu la r Enzym ology and Eng ineering of M in istry of Educa tion, J ilin U n iversity, C hangchun 130021, Ch ina )A b s tra c t: F ic in and p ap a in a re bo th cyste ine p ro te ina se. Comp a rison of the p rim e r struc tu re s sugge sts the

4、sim ila ritie s be tween the ac tive site po rtion s of p ap a in and fic in. In the p re sen t study the p rop e rtie s of fic in we re ana lyzed to fu rthe r know abou t the enzym e and to extend the comp a rison of it w ith p ap a in. B e ing d iffe ren t from p ap a in, fic in d isp lays a re si

5、stance to lowe r temp e ra tu re s, a w ide r range of pH va lue s, and be tte r b ind ing of sub stra te. The re su lt sugge sts tha t fic in is su itab le fo r app lica tion.Ke y w o rd s: fic in; p ap a in; comp a rison of enzym a tic cha rac te ristic s根据植物蛋白酶结构的不同可将其分为 4类 : 巯基蛋白酶 、丝氨酸蛋白酶 、酸性蛋白酶

6、和金属蛋白酶. 植物体内的蛋白酶除参与蛋白质的分解与迁移外 , 还与细胞间信号传导有关 . 从植物中提取纯 化的蛋白酶 , 因其稳定性好 、蛋白水解能力强 , 对多种蛋白质均具有很好的降解作用 , 目前已被广泛应用于食品加工 、工业生产和医疗卫生等领域 1 , 2 .应用较 广 的 植 物 蛋 白 酶 主 要 有 两 种 : 无 花 果 蛋 白 酶 和 木 瓜 蛋 白 酶 . 木 瓜 蛋 白 酶 ( Pap a in ) ( 3. 4. 22. 2 )存在于番木瓜 ( C a rica Papaya )的树胶中 , 由 212 个氨基酸残基构成单链巯基蛋白酶 3 , 其 一级结构 4 和立体结

7、构均已被阐明 5 . 无花果蛋白酶 ( F ic in) ( 3. 4. 22. 3 )是榕属 ( F icus)植物树的树胶 中有蛋白水解酶活性的组分 6 . 两者均为巯基蛋白酶 , 分子量约为 24 000 , 等电点约为 9. 0 , 最适水解 温度约为 60 , 其活性中心附近的氨基酸序列有较高的同源性 :Pap a in: P ro2V a l2L ys2A sn2Gln2Gly2Se r2Cys2Gly2Se r2Cys2TrpF ic in: P ro2Ile2A rg2Gln2Gln2Gly2Gln2Cys2Gly2Se t2Cys2TrpPap a in: V a l2Gly

8、2P ro2Cys2Gly2A sn2L ys2V a l2A sp 2H is2A la2V a l2A la2A la2V a l2Gly2TyrF ic in: Th r2Gly2P ro2Cys2Gly2Th r2Se r2L eu2A sp 2H is2A la2V a l2A la2L eu收稿日期 : 2008 203 214.作者简介 : 曲和之 ( 1980 ) , 男 , 汉族 , 博士研究生 , 从事分子生物学与生物化学的研究 , E2m a il: quhezh i em ail. jlu. edu. cn.联系人 : 王晓平 ( 1953 ) , 女 , 汉族 , 副

9、教授 , 从事分子生物学与生物化学的研究 , E2m ail: wangxiaop ing jlu. edu. cn.因此 , 水解的底物也具有很大的相似性 .本文对无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的最适反应温度 、热稳定性 、最适 pH 值 、pH 值稳定性以及水 解底物 BA PA 的 Km 值进行比较 , 对进一步开展无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的应用提供了理论依据 .1 材料与方法1. 1 材料及仪器木瓜蛋白酶购于广西南宁庞博生物公司 ; 标准品无花果蛋白酶购自美国 Sigm a 公司 ; 纯化无花果 蛋白酶由本实验室自制 7 ; 苯甲酰 2DL 2精胺酰对硝基苯胺 (BA PA )购自瑞典 Fu

10、 lka公司 ; L 2半胱氨酸购 自中国鼎国公司. 其他所用化学试剂均为分析纯 .主要仪器有 CR G高速冷冻离心机 (日本 H itach i公司 ) , UV 21700 紫外分光光度计 (日本 SH IMAD 2ZU 公司 ) , UV 22550紫外分光光度计 (日本 SH IMAD ZU 公司 ) .1. 2 实验方法1. 2. 1 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶最适反应温度的比较参考文献 8 的方法 , 以 BA PA 法测定酶活 力 . 在 1. 5 mL 的 EP 管 依 次 加 入 10 L 激 活 剂 L 2cys, 10 L 酶 ( 1. 0 g /L ) , 180 L p

11、H = 7. 0 的0. 1 mo l /L磷酸缓冲液 (含 1 mmo l /L ED TA ) , 750 L 底物 1 mmo l /L 的 BA PA. 在 20 , 30 , 40 , 50 , 60 , 70 ,80 分别反应 1 h后 , 加入 50 L 冰醋酸终止反应 , 在 410 nm 测光密度值.1. 2. 2 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶热稳定性的比较 取无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶各 10L , 分别在50 , 60 , 70 三种温度下处理 10 , 20 , 40 , 60 m in, 再依次加入激活剂 L 2cys、磷酸缓冲液 (含 1 mmo l /L ED TA )

12、 、底物 BA PA 在常温 ( 37 )下反应 1 h, 加入冰醋酸终止反应 , 在 410 nm 下测其光密度 .1. 2. 3 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶最适 pH 值比较 在 1 8号 EP管中各加入 BA PA 和激活剂 L 2cys,再依次加入 pH 为 3. 0 , 4. 0 , 5. 0 , 6. 0 , 7. 0 , 8. 0 , 9. 0 , 10. 0的缓冲液 , 之后加入酶溶液 , 在常温 ( 37 )下 反应 1 h后 , 加入冰醋酸终止反应 , 在 410 nm 下测光密度 .1. 2. 4 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶 pH 值稳定性的比较 分别向 1 5号 EP管中依

13、次加入 pH 为 3. 0 ,4. 0 , 7. 0 , 9. 0 , 10. 0的缓冲液和酶溶液 , 在 37 下放置 10 , 20 , 40 , 60 m in, 再用 pH = 7. 0的缓冲液调节 整个反应体系到 pH = 7. 0 , 最 后 加入 激活 剂 L 2cys和底 物 BA PA 反 应 1 h 后用 冰醋 酸 终止 反应 , 在410 nm下测其光密度 .1. 2. 5 动力学常数 ( Km )的测定 在 EP管中分别加入激活剂 L 2cys、pH = 7. 0 的 0. 1 mo l /L 磷酸缓冲 液和 1. 0 g /L 的蛋白酶 , 再加入不同浓度的 BA P

14、A ( 0. 5 , 0. 667 , 1. 0 , 1. 5 , 2. 0 mmo l /L ) , 混匀后放入 UV 22550紫外分光光度计内反应 , 反应温度为 60 , 记录反应开始后前 60 s的数据 , 根据 L ineweave r2B u rk法做图 , 求得 Km 值 .2 结果与讨论2. 1 木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶最适反应温度的比较图 1为无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶最适反应温 度的比较结果 . 由图 1可见 , 木瓜蛋白酶在 70 左 右酶活最高 , 标准无花果蛋白酶在 60 左右酶活最高 , 纯化的无花果蛋白酶在 50 左右酶活最高 . 无花果 蛋 白酶 在 35 仍可

15、 以保 持 60 %以 上 的 活 性 , 因此较适合应用于常温条件下的反应 . 而木瓜 蛋白酶在 80 时还有较高的活性 ( 60 % ) , 表明该 酶具有抗高温的特性 , 较适合应用于高温环境的反应 .2. 2 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶热稳定性的比较酶的热稳定性比较实验结果如图 2 所示 . 由图图 1 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶最适反应温度的比较F ig. 1 C om pa r ison be tween op t iona l rea c t ive tem pera ture s of pa pa in an d f ic in第 6期曲和之 , 等 : 无花果蛋白酶与木瓜蛋白酶酶

16、学性质的比较12192 可见 , 木瓜蛋白酶和标准无花果蛋白酶在 50 和 60 放置 1 h后 , 活力只有 30 %左右. 纯化的无花果蛋白酶在 50 下稳定性良好 , 放置 1 h酶活力仍有 80 %以上 , 在 60 放置 1 h后 , 活力不足 20 %.3 种酶在 70 时稳定性均较差 , 放置 10 m in后均无活力 .图 2 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的热稳定性F ig. 2 Therm o sta b il it ie s of f ic in an d pa pa in2. 3 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶最适合 pH值的比较图 3为 pH 值对 3种酶活力的影响曲线. 由图

17、3 可见 , 木瓜蛋白酶在 pH = 8. 0左右达到最大值 , 而 标准无花果蛋白酶和纯化无花果蛋白酶在 pH = 7. 0左右达到最大值 . 当 pH 10. 0 时 , 3 种酶均无活 性 . 无花果蛋白酶在 pH = 5. 0 9. 5 范围内均保持较 高 的 活 性 , 其 范 围 大 于 木 瓜 蛋 白 酶 的 pH = 6. 59. 5. 因此 , 可以认为无花果蛋白酶比木 瓜蛋白酶有更广泛的应用前景.2. 4 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶 pH 值稳定性的 比较无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的 pH 值稳定性比图 3F ig. 3pH值对 3种酶活力的影响Effec t of pH on

18、 the a c t iv it ie s of f ic in an d pa pa in较结果如图 4所示. 由图 4可见 , 3种酶在 pH = 710时稳定性均比较好. 在 pH = 3. 0 时 , 木瓜蛋白酶和 标准无花果蛋白酶活性下降较快 , 放置 1 h 活力降为 20 %左右 , 纯化无花果蛋白酶在 pH = 3. 0 时稳定性较好 , 放置1 h 活力仍有 70 %左右. 3 种酶在pH = 10. 0的碱性条件时 , 活性下降较快 : 木瓜蛋白酶放置 1 h活力仅余 20 %左右 , 纯化无花果蛋白酶放置 1 h活力为 35 %左右 , 标准的无花果蛋白酶的稳定性最好 ,

19、 放置 1 h活力仍保持 70 %.图 4 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的 pH值稳定性F ig. 4 S ta b il it ie s of f ic in an d pa pa in a t d ifferen t pH va lue s2. 5 无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的 Km 值3种酶的 Km 值曲线如图 5所示 , 根据米氏常数公式 , 计算在 60 时对于底物 BA PA , 木瓜蛋白酶 : Km = 2 368. 3 /145. 72 = 16. 25 mmo l /L; 标准无花果蛋白酶 : Km = 1 799 /258. 41 = 6. 96 mmo l /L; 纯无花果蛋白

20、酶 : Km = 1 145. 7 /419. 4 = 2. 73 mmo l /L.图 5 蛋白酶水解 BA PA 的 L in ewea ver2Burk曲线F ig. 5 L in ewea ver2Burk p lo ts of pa pa in an d f ic in由以上结果可见 , 无花果蛋白酶较木瓜蛋白酶对底物具有更好的亲合性 , 而纯化的无花果蛋白酶 比标准的无花果蛋白酶亲和性更好 .综上所述 , 本文对无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的部分理化性质进行了比较研究. 实验结果表明 ,木瓜蛋白酶 、标准无花果蛋白酶和纯无花果蛋白酶水解的最适温度分别为 40 , 50 , 60 ; 温

21、度稳定性实 验显示 , 无花果蛋白酶优于木瓜蛋白酶 ; 最适合 pH 值分别约为 8. 0 , 7. 0 , 7. 0; pH 稳定性研究表明 , 无 花果蛋白酶的反应温度范围比木瓜蛋白酶的反应温度范围更大 ; 对 BA PA 的 Km 研究显示 , 无花果蛋 白酶对底物 BA PA 的亲和性较木瓜蛋白酶好 . 由上述结果可见 , 无花果蛋白酶比木瓜蛋白酶应用范围 更广.参考文献Mo rce lle S R , Tre jo S A , Cana ls F, e t a l. Funa stra in c : a Cyste ine Endop ep tida se Pu rified fro

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