新药研发中药物分析方法建立与验证课件.ppt
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1、新药研发中药物分析方法建立与验证,袁艳娟2015.04.17,2023/3/10,2,分析方法的设计依据分析方法建立的一般步骤分析方法验证的内容与要求药物分析应用示例,内容提要,2023/3/10,3,第一节 分析方法的设计依据,建立分析检测方法的主要依据待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况分析测定的目的与要求生物样品的类型与预处理方法实验室条件,2023/3/10,4,一、待测药物的理化性质及体内存在状况,准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物预处理待测物从结合物或缀合物中释放选择样品预处理方法首先应考虑待测药物的理化性质药物在生物体内的存在状况药物在生物体内的生物转化(代谢)途径,20
2、23/3/10,5,(一)待测药物的理化性质,药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等预处理及检测方法具有亲脂性在适当的pH值下用溶剂萃取具有强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等具有挥发性GC测定法具有光谱或电化学特性分析检测方法药物的稳定性萃取浓缩技术对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂对热不稳定避免高温蒸发溶剂,2023/3/10,6,(二)待测药物的体内存在状态,与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低分离萃取方法蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物分析检测技术浓度较低(尤其有代谢产物共存)代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采用LC-
3、MS等分析检测技术,2023/3/10,7,二、分析测定的目的与要求,药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程血浆浓度随时间的变化过程;代谢途径及代谢产物要求同时测定原形药物和代谢产物检测宽线性范围(CmaxCmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属 性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)方法不必强调方法的简便、快速;大多采用色谱及其脱线或在线联用技术,如HPLC、LC-MS 毒代动力学确定新化合药物预期人用剂量水平与其毒性水平之间的安全范围,2023/3/10,8,三、生物样品的类型与预处理方法,生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用以血浆或血清为分析样
4、品蛋白沉淀 溶剂萃取分析样品较为“干净”,可用HPLC或HPLC-MS检测,2023/3/10,9,四、实验室条件,在设计体内药物分析方法时,还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备,合理选择可行的分析方法。,2023/3/10,10,第二节 分析方法建立的一般步骤,一、分析方法的选择二、分析方法的建立(一)检测条件的筛选(二)分离条件的筛选,2023/3/10,11,一、分析方法的选择,体内药物分析方法的设计生物样品中的药物浓度决定分析方法的首要因素生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少难以通过增加取样量提高方法灵敏度通过选择适当的分析方法适应样品分析需求,20
5、23/3/10,12,二、分析方法的建立,分析方法建立之前查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学过程,使所拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定,2023/3/10,13,二、分析方法的建立,初步拟定分析方法后进行一系列试验工作选择最佳分析条件同时验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的 分析方法的建立步骤第一步:检测条件的筛选第二步:分离条件的筛选,2023/3/10,14,(一)检测条件的筛选,标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度HPLC 调整检测器(类型、
6、条件)色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)流动相(组分及其配比)及其流速 柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)良好的色谱参数(n、R、T)适当的保留时间(tR),2023/3/10,15,(二)分离条件的筛选,在进行分离条件筛选时,应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰,步骤如下:1空白溶剂试验 溶剂(方法特异性)2空白生物基质试验 endogenous compounds(方法特异性)3模拟生物样品试验 方法效能指标4实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性),2023/3/10,16,2.空白生物基质试验,空白生物基质(b
7、lank biological matrix)如空白血浆 考察目标生物基质中内源性物质对测定的干扰(方法特异性)在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”(信号附近的有限范围)内不应出现内源性物质信号,2023/3/10,17,3.模拟生物样品试验,模拟生物样品(质量控制,QC样品)空白生物基质中加入待测药物考察目标方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度 药物的萃取回收率等各项技术指标同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度,即方法特异性,2023/3/10,18,4.实际生物样品的测试,空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件不能
8、完全确认是否适合于实际生物样品的测定药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)实际生物样品确立分析方法后,尚需进行实际生物样品的测试考察目标代谢产物对药物、内标物质的干扰情况进一步验证方法的可行性,2023/3/10,19,第三节 分析方法验证的内容与要求,验证步骤:首先为分析方法的验证 特异性、精密度与准确度、回收率定量限与检测限、溶液稳定性其次为生物基质中待测药物稳定性的验证 室温放置、冷冻(或冷藏)、冻-融循环,2023/3/10,20,验证的效能指标与基本要求,1特异性避免干扰2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围3准确度与实际
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