放射免疫检测技术课件.ppt
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1、基本内容,一、放射免疫检测技术的基本原理二、放射免疫分析(RIA)三、免疫放射分析(IRMA)四、RIA与IRMA的比较五、放射免疫分析中造成测量误差的因素六、核废物的处理七、应用八、课堂小结九、作业,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念2、常用的放射性核素3、放射性核素的选择原则4、放射性标记的抗原或抗体的要求5、制备放射性核素标记物6、放射性标记物的纯化7、理想的分离技术8、免疫复合物分离常用方法9、核射线探测仪器的探测原理,1、7个基本概念放射性核素:是指原子核能自发地产生成分或能级的变化,在变化时伴有射线的发射(放射性),然后变成另一种元素的核素。,一、放射免疫检测技术的基
2、本原理,放射量单位有:放射性活度 放射性比活度 放射性浓度,1、7个基本概念放射性活度:一定量的放射性核素在单位时间内的核衰变数,即每秒核衰变次数。单位:贝可勒尔(Becquerel,Bq)1Ci=3.71010Bq,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念放射性比活度:是指固体样品的放射性活度,即单位质量样品中所含放射性活度,以Bq/g或Bq/mmol表示。放射性浓度:是指液体样品的放射性活度,即单位体积溶液中所含放射性活度,以Bq/ml表示。,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念比活度:是单位质量标记物的放射强度,单位为Bq/g。标记抗原的比放射性越高,所需标记抗原量越
3、少,实验系统的敏感度越高。但过高的比放射性可能会损伤抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为宜。,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念放射化学纯度:是指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率。影响因素:被标记物不纯,杂质也被放射性核素标记;标记后的分离纯化不完全;标记化合物贮存过程中的碘脱落。,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念免疫活性:指标记抗原结合于抗体的放射强度占总放射强度的百分率。以检查标记后免疫活性损失情况。,一、放射免疫检测技术的基本原理,2、常用的放射性核素:放射性核素依据衰变方式分、三种,用于放射性标记的有和两类;分别用液体闪烁计数器及计数器测定
4、。型:3H(最常用)、14C和32P。型:125I(最常用)、131I、51Cr和60Co。,一、放射免疫检测技术的基本原理,125I和3H标记物特点比较,3、放射性核素选择原则 高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗体没损害、容易标记。4、放射性标记的抗原或抗体的要求 纯度高、灵敏、有足够或完整的免疫活性、高亲和常数、特异性强、交叉反应率低。,一、放射免疫检测技术的基本原理,5、制备放射性核素标记物直接标记法 将125I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残基苯环上,形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。操作简便,结合效率高,但只能标记含酪氨酸的化合物,有时可能会损害蛋白质的活性。间接标记法 先将放射性碘连接到一个
5、小分子载体上,再将这个小分子载体与蛋白质结合。,一、放射免疫检测技术的基本原理,6、放射性标记物的纯化 可用葡聚糖凝胶过滤法或薄层层析法、纸层析法、电泳法、高效液相层析法等。理想的放射性标记物:高放射化学纯度 适当的比放射性 高的免疫活性。,一、放射免疫检测技术的基本原理,7、理想的分离技术简便易行,适于大批量样品分析;分离效果完全、快速,非特异结合低;试剂来源容易、价格低廉、稳定性好、可长期保存;不受外界因素和样品中其他组分的干扰,对标准品和待测抗原分离效果相同;适合自动化分析的要求。,一、放射免疫检测技术的基本原理,8、免疫复合物分离常用方法.吸附法 用吸附剂(如活性炭)吸附小分子的游离。
6、.化学沉淀法 RIA反应条件接近抗体的等电点,加入聚乙二醇(PEG)等蛋白质沉淀剂可破坏蛋白分子表面的水化层而使蛋白沉淀,从而分离B与F。.双抗体法 利用抗抗体和Ag-Ab复合物中的抗体结合,形成更大免疫复合物,离心沉淀即可分离B与F。.PR试剂 将双抗体法和PEG结合起来的沉淀法,可弥补各自的不足,分离效果好,适用范围广。.固相分离法 将抗体或抗原结合在固相载体(如磁颗粒、聚苯烯管子或珠等)上,利用固相抗体或抗原分离B和F,具有简便、快速、适合于自动化分析等特点,已逐步取代传统的液相分离方法。,一、放射免疫检测技术的基本原理,9、核射线探测仪器的探测原理 核射线探测器是个能量转化器,其检测原
7、理是当射线作用于闪烁体,闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发,当受激的原子或分子退激时,则发出光子进入光电倍增管光阴极,转换为光电子,光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极,形成电脉冲。转换模式:放射能光能电能脉冲。,一、放射免疫检测技术的基本原理,二、放射免疫分析(RIA),1、基本原理 抗原抗体竞争性结合反应,即待测抗原(Ag)和定量的标记抗原(Ag)与限量的抗体(Ab)进行特异性反应,其中Ab的结合位点数小于AgAg的结合位点总数,则Ag和Ag与Ab发生竞争性结合。如待测Ag含量多,则Ag-Ab复合物形成得多,Ag-Ab复合物(B)形成少,游离的Ag(F)多,反之亦然。,二
8、、放射免疫分析(RIA),2、分类 根据加样顺序不同,RIA可分为2个类型:平衡法 将Ag和Ag同时与Ab反应,达到平衡后分离Ag-Ab和Ag,方法稳定,但敏感度稍差;顺序饱和法 先将待测Ag与Ab充分反应,达平衡后再加入Ag,敏感度提高,稳定性不如平衡法。,二、放射免疫分析(RIA),3、数据处理根据放射性核素的类型分别选用液体闪烁计数仪(型)和计数仪(型),测定各待测标本和备抗原标准品的Ag-Ab放射性强度(B)或游离Ag放射性强度(F)。制作标准曲线时,纵坐标为放射性反应参数,有各种表示方式,可选用B/F、B/(BF)、F/B、B/B0(零标准管)等比值或B或F的cpm(脉冲)值,常选用
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