感染性疾病免疫学检测PPT讲稿课件.ppt
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1、感染性疾病免疫学检测课件,2023/3/9,2,什么是感染性疾病?,感染性疾病不一定会传染,而传染病一定是感染性疾病,一部分疾病可以通过各种方式,如接触、消化道、呼吸道、昆虫叮咬等在正常人体间传播,具有较强的传染性,对社会危害极大,这一类疾病被归于传染病范畴。,感染性疾病,传染病,非传染病,是由各种病原体,如病毒、细菌、支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫等引起的疾病。,2023/3/9,3,感染免疫,感染,致病,病原体对机体的感染,非特异性免疫,特异性免疫,机体的抗感染免疫作用,?,2023/3/9,4,特异性免疫,抗体,感染免疫,2023/3/9,5,人体内的5种抗体,H链:,.(Alpha)(
2、Gamma)(Mu)(Delte)(Epsilon)Ig 种类 IgA,IgG,IgM,IgD,IgE,2023/3/9,6,免疫球蛋白的水解片段,2023/3/9,7,免疫学检测技术基本原理,基于抗体抗原的结合具有特异性和专一性的特点,利用已知 Ag,未知 Ab,利用已知 Ab,未知 Ag,检测,检测,Ag,+,Ab,Ag-Ab,2023/3/9,8,免疫学检测技术的类型,荧光标记技术放射免疫标记技术酶免疫技术胶体金免疫技术化学发光免疫分析电化学发光免疫分析,免疫标记技术,经典血清学技术,凝集反应沉淀反应补体结合反应中和反应,2023/3/9,9,要保证检验结果的正确性和可靠性,必须对实验的
3、检测原理及整个过程中各个环节的干扰因素,有比较清楚的掌握和了解。了解这些干扰因素,对于我们在临床工作中如何注意和解决这些干扰,以及实验结果的解释具有重要意义。,2023/3/9,10,常用检测项目,乙肝两对半检测梅毒螺旋体抗体检测HCV抗体检测HIV抗体检测,2023/3/9,11,一、乙肝两对半检测,项目HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb,检测技术 ELISA化学发光时间分辨荧光免疫层析,检测方法 夹心法竞争法,检测结果 定性定量,2023/3/9,12,双抗体夹心法模式:,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,(一)、HBsAg,双抗体夹心法:两步法,一步法,HBsAg抗原表位1
4、、共同决定簇:a(aa124-147);2、型特异决定簇:(1)d/y(aa122,赖氨酸/精氨酸);(2)w/r(aa160,赖氨酸/精氨酸);四种亚型:adr、adw、ayr、ayw。,2023/3/9,13,(一)、HBsAg,检测中常见的问题,1、一步法测定中的钩状效应(Hook effect):,2023/3/9,14,一步法检测时,受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及标记抗体结合,而不能形成“固相抗体抗原标记抗体”夹心复合物,所得结果将低于实际的含量,这种现象称为钩状效应。钩状效应严重时,可出现假阴性结果。,(一)、HBsAg,双抗体夹心一步法的钩状效应,2023/3/9
5、,15,固相载体,固相Ab,Ag,标记Ab,(一)、HBsAg,钩状效应是HBsAg一步法检测时不可避免的现象;由于钩状效应的存在,一步法检测HBsAg所得到的检测信号无法确定其真实性;解决钩状效应的根本方法为固相抗体与抗原反应后分离游离抗原,再加标记抗体的两步法检测:第一步:包被抗体捕获抗原成为固相,然后分离游离抗原;第二步:固相抗原与标记抗体结合,分离液相标记抗体后记录检测信号。,2023/3/9,16,(一)、HBsAg,两步法检测能消除钩状效应:,2023/3/9,17,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,(一)、HBsAg,2、人抗鼠抗体效应(Human anti-mouse effec
6、t,HAMA效应)对检测的干扰,2023/3/9,18,产生HAMA的原因:,经常接触老鼠;肿瘤病人进行鼠单克隆抗体的治疗。,用鼠源McAb检测HBsAg时,如样品中有HAMA,就会产生假阳性或假阴性。,非鼠源的PcAb可消除HAMA效应。,(一)、HBsAg,HAMA效应的假阳性模式:标本中的人抗鼠抗体分别与固相HBsAb和标记HBsAb McAb结合,形成固相HBsAbHAMAHBsAb复合物。,2023/3/9,19,固相载体,固相McAb,标记McAb,人抗鼠抗体,(一)、HBsAg,3、S基因突变引起的HBsAg漏检:,基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个氨基酸置换、缺失或插入,H
7、BsAg 蛋白质氨基酸组成发生改变,导致其抗原性产生变化。变异率高,自然变异和免疫逃避,变异无地域性。HBsAg抗原性发生改变,不能被野生型HBsAb所识别。不一定HBsAg抗原性发生改变后就一定漏检。很多时候野生型与突变型是混合存在的,这种情况虽然有突变,同样可以检出。,2023/3/9,20,(一)、HBsAg,2023/3/9,21,固相载体,HBsAg McAb(“a”),HBsAg McAb(“a”),标记McAb(抗“d”),标记PcAb(抗“r”),4、PcAb检测HBsAg(adr)的灵敏度高于McAb,标记PcAb(抗“d”),HBsAg,标记McAb(抗“d”),(一)、H
8、BsAg,5、标本自身及前处理引起的干扰因素,2023/3/9,22,(一)、HBsAg,类风湿因子嗜异性抗体自身抗体补体纤维蛋白溶血或黄疸交叉反应性物质外源性物质(污染、抗生素和生物制剂等),6、操作不当或人为等外在因素,2023/3/9,23,(一)、HBsAg,标本编号、加样或加试剂差错孵育洗板结果判读和报告失误等,ELISA检测模式:一步法。原材料:McAb;检测结果:定性。缺点:钩状效应,灵敏度较差,HAMA干扰、RF干扰,不能定量。化学发光(某些公司)检测模式:一步法。原材料:McAb;检测结果:定量。灵敏度好于ELISA,无RF干扰。缺点:钩状效应,HAMA干扰,定量结果不能溯源
9、到国际标准。,2023/3/9,24,(一)、HBsAg,常见HBsAg检测情况:,Abbott公司检测模式:两步法。原材料:McAb(固相),PcAb(Fab,标记抗体);检测结果:定量。优点:1)无钩状效应;2)无HAMA、无RF干扰;3)灵敏度高;4)加用了针对不同突变株病毒抗原的检测抗体,可以进行HBsAg突变株的检测;5)定量结果可溯源到国际标准。,2023/3/9,25,(一)、HBsAg,时间分辨荧光检测模式:两步法。原材料:McAb(固相),PcAb(标记抗体);检测结果:定量。特点:无钩状效应;灵敏度高;无HAMA干扰。不能进行HBsAg突变株的检测,可能有RF干扰,定量结果
10、不能溯源到国际标准。,2023/3/9,26,(一)、HBsAg,目前国际上常用的HBsAg标准物质:德国兰根埃尔利希研究所(Paul Ehrlich Institute)参考物:PEI/ml;法国参考物:ng/ml;雅培参考物:ng/ml(Axsym),IU/ml(i2000);NIBSC参考物(WHO):IU/ml.(英国国家生物标准与检定所,National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)1 IU/ml=0.58 PEI/ml=1.93“法国”ng/ml=5.59 雅培ng/ml,2023/3/9,27,(一)、
11、HBsAg,原材料:HBsAg1、天然HBsAg:血源的纯HBsAg,即S蛋白(小球形颗粒);,2023/3/9,28,HBsAg小球型颗粒(2022nm)Dane颗粒(40 42nm)管型颗粒,(二)、HBsAb,2、基因工程重组抗原(rHBsAg),2023/3/9,29,(二)、HBsAb,2023/3/9,30,HBsAb为分别针对HBsAg五种表位(a、d/y、w/r)的不同抗体,其中90%的HBsAb为针对“a”的抗体,为最重要的保护性体,对不同亚型感染均有保护作用(但交叉免疫不完全),也是HBsAb各种抗体中最重要的血清标志物。用于检测HBsAb的抗原,无论天然抗原或重组抗原,必
12、须具有“a”表位,一般为ad、ay亚性联合应用。目前HBsAb试剂原材料质量优良,检测方法为双抗原夹心法,定量定性检测的结果较准确可靠。,(二)、HBsAb,HBsAg阳性+HBsAb阳性模式讨论在HBV感染及机体免疫过程中,可能有HBsAg和HBsAb同时存在的短暂过程,但很难出现在检测过程中:HBsAg过剩时,HBsAb与其结合,以抗原抗体复合物形势存在,血中测不到游离抗体。HBsAb过剩时,HBsAg以抗原抗体复合物形势存在,血中测不到游离抗原。由于抗原抗体反应是可逆的,在检测灵敏度大幅提高的情况下,上述情况不能绝对化。,2023/3/9,31,(二)、HBsAb,HBsAg阳性+HBs
13、Ab阳性模式讨论部分HBV的S基因突变引起“a”决定簇氨基酸组成发生改变,导致其抗原性产生变化,野生株抗HBs不能将其清除。不同亚型HBV感染。两株不同亚型HBV感染及机体免疫过程:1、两株不同亚型HBV同时或先后感染同一个体,合成两种不同亚型的HBsAg1和HBsAg2;2、前者刺激机体产生HBsAb1,后者未刺激机体产生HBsAb2;3、HBsAb1中和了相应的HBsAg1而不能中和HBsAg2,HBsAg2与HBsAb1同时存在。,2023/3/9,32,(二)、HBsAb,常见HBsAb检测情况:ELISA原材料:天然抗原。检测模式:一步法。检测结果:定性,半定量。缺点:可能出现假阳性
14、,定量结果干扰因素较多。化学发光原材料:天然抗原。检测结果:定量。检测模式:一步法。,2023/3/9,33,(二)、HBsAb,Abbott原材料:重组抗原。检测模式:两步法。检测结果:定量。时间分辨荧光原材料:天然抗原。检测模式:两步法。检测结果:定量。,2023/3/9,34,(二)、HBsAb,检测方法和影响因素类似于HBsAg,2023/3/9,35,(三)、HBeAg,方法:竞争法。原材料:1)McAb HBeAb;2)rHBeAg。存在问题:原材料:大肠杆菌表达的基因工程抗原(rHBeAg/E.coli):优点:稳定性好,使用安全,价格低廉。缺点:特异性差。1、HBeAg和HBc
15、Ag是基因同源性很高的两种抗原,但具有完全不同的抗体结合表位,与HBcAg间存在明显的交叉抗原性;2、菌体杂质干扰检测。很多人感染过大肠杆菌,血清中的抗大肠杆菌抗体能与重组抗原中的成分结合。,2023/3/9,36,(四)、HBeAb,由于检测抗原特异性差,不能采用双抗原夹心法、间接法、捕获法等反应模式。,2023/3/9,37,固相载体,HBeAg/E.coli,HBcAb,标记HBeAg/E.coli,Ag/E.coli,抗E.coli抗体,标记Ag/E.coli,夹心法时的假阳性结果,固相载体,HBeAg/E.coli,HBcAb,标记抗人IgG,Ag/E.coli,抗E.coli抗体,
16、标记抗人IgG,间接法时的假阳性结果,(四)、HBeAb,解决办法:采用HBeAb McAb,用竞争法检测HBeAb,避免样本中HBcAb及抗大肠杆菌抗体的干扰:,2023/3/9,38,固相载体,rHBeAg,HBcAb,标记HBeAb,抗E.coli,Ag/E.coli,阴性结果,1)液相-液相竞争法(一步法)检测HBeAb,2023/3/9,39,固相载体,rHBeAg,HBeAb(标本),标记HBeAb,阳性结果,(四)、HBeAb-检测模式 1,1)液相-液相竞争法(一步法)检测HBeAb,2023/3/9,40,固相载体,rHBeAg,酶标HBeAb,阴性结果,(四)、HBeAb-
17、检测模式 1,液相-液相竞争法检测HBeAb时,标本中的HBeAg对检测结果的干扰,2023/3/9,41,固相载体,HBeAg(标本),rHBeAg,标记HBeAb,液相-液相竞争法检测HBeAb时,标本中的HBeAg对检测结果的干扰,2023/3/9,42,固相载体,HBeAg(标本),rHBeAg,标记抗体,假阳性结果,2)固相-液相-液相竞争法,2023/3/9,43,固相载体,HBeAb,HBeAb(标本),标记HBeAb,rHBeAg中和试剂,阳性结果,(四)、HBeAb-检测模式 2,2)固相-液相-液相竞争法,2023/3/9,44,固相载体,HBeAb,标记HBeAb,rHB
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