微生物细胞破碎2 4全解课件.ppt

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1、2023/3/9,生物分离过程的一般流程,本节内容,2023/3/9,微生物细胞破碎cell disruption,第一节 细胞壁的组成 与结构第二节 常用破碎方法第三节 破碎率测定 第四节 包涵体的纯化 方法,2023/3/9,知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。难点：常用破碎方法的合理选用。,2023/3/9,概 述(目的和意义),细胞破碎（cell rupture）是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细

2、胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。,2023/3/9,第一节 细胞壁的组成与结构,不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。,2023/3/9,1、细菌细胞壁结构,细菌的细胞壁都是由肽聚糖、胞壁酸、蛋白质、脂多糖等组成；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围。,2023/3/9,破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和交联的程度。革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不

3、同。革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。,2023/3/9,2、酵母细胞壁结构,最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状；中间一层是糖蛋白；最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物；破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,2023/3/9,3、真菌细胞壁,真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的

4、强度和聚合物的网状结构有关，而且它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,2023/3/9,红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物最外层(a)是-和-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。,红面包霉菌细胞壁的结构示意图,4、植物细胞壁,构架物质：纤维素基质：果胶典型结构：胞间层 初生壁 次生壁,2023/3/9,细胞壁的组成和结构,2023/3/9,第二节 细胞破碎技术,2023/3/9,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法超声法,物理破碎,温差破碎法压差破碎法,化学破碎,有机溶剂表面活性剂酸碱,酶促破碎,自溶法外

5、加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏,细胞破碎方法及其原理,2023/3/9,一、机械法,高压匀浆破碎法（homogenization）珠磨破碎法（bead grinding）超声波破碎法（ultrasonication）,2023/3/9,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）,1、高压匀浆法（High-pressure homogenization）,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷

6、出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。,2023/3/9,高压匀浆器的种类,高压匀浆器的种类较多：WAB公司的AVP Gaulin 31MR型Bran and luebbe 公司SHL40型意大利Niro Soavi,高压匀浆机,2023/3/9,高压匀浆法使用时注意事项,高压匀浆器的操作温度上升约-/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。,2023/3/9,高压匀浆法适用的范围,（大规模细胞破碎的常用方法）适用范围 酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液

7、细胞浓度可以很高，20%左右。不宜使用 易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,2023/3/9,压力压力增加可减少细胞的循环次数，最好一次通过就可完全的破碎。但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加。工业生产中，通常采用的压力为5570Mpa。菌体种类和生长环境大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养 基上容易破碎。,影响高压匀浆器细胞破碎因素,2023/3/9,2）珠磨法 bead mill,细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与

8、细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。,WSK卧式高效全能珠磨机,2023/3/9,3）超声波破碎（Ultrasonication),利用超声波振荡器发射的15-25kHz超声波处理细胞悬浮液。在超声波作用下液体发生空化作用,液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。,2023/3/9,JY92-II D超声波细胞粉碎机,超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种类型，一般破碎效果后者比前者好。破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。操作过程产生大量的热，操作需在冰水或外部冷

9、却的容器中进行。,2023/3/9,适用范围,杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低。由于对冷却的要求相当苛刻，且大规模操作中声能传递和散热有困难，不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。,2023/3/9,不同机械破碎方法的比较,2023/3/9,二、非机械破碎方法,酶溶破碎法（enzyme lysis）化学破碎法（chemical treatment）渗透压冲击破碎法（osmotic shock）冻融破碎法（freezing and thawing）,其中酶法和化学法溶胞应用最广。

10、,酶溶破碎法（enzyme lysis）化学破碎法（chemical treatment）渗透压冲击破碎法（osmotic shock）冻融破碎法（freezing and thawing）,其中酶法和化学法溶胞应用最广。,酶溶破碎法（enzyme lysis）化学破碎法（chemical treatment）渗透压冲击破碎法（osmotic shock）冻融破碎法（freezing and thawing）,2023/3/9,1、酶解（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法,2023/3

11、/9,外加酶法,酶解法的特点是专一性强，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，主要用于细菌类细胞壁的裂解。,2023/3/9,放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，可采用溶菌酶。酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,2023/3/9,2)酶解-自溶作用,自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目

12、的。缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,2023/3/9,酶解法的特点,优点发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点溶酶价格高溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在,2023/3/9,有选择性的加入某些化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择性地渗透出来。,2、化学渗透法（Chemical permeation）,取决于化学试剂类型以及细胞壁膜的结构与组成。,常用化学试剂有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等,2023/3/9,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6

13、mol/L HCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。,（1）酸、碱处理法,2023/3/9,细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等,（2）表面活性剂,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,2023/3/9,能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。,（3）有机溶剂,（4）EDTA螯合剂,处理G-细菌，对

14、细胞壁外层有破坏作用。G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。,非极性R基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸 小分子氨基酸静电引力可以渗透过细胞壁中，通过氢键、范德华力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构。,（5）温和化学渗透剂处理,2023/3/9,通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒；化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。,化学渗透法特点,缺点,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋

15、白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,优点,2023/3/9,3、物理法,渗透压冲击法冻结-融化法干燥法,2023/3/9,1）渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,2

16、023/3/9,2）冻结-融化法,将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次达到破壁作用；一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂；适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,2023/3/9,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质,3）干燥法,2023/3/9,2023/3/9

17、,三、选择破碎方法的依据,细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；细胞处理量；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；目标产物的选择性释放。,2023/3/9,四、选择性释放目标产物的一般原则,仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较温和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液pH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。,2023/3/9,(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相

18、同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。,2023/3/9,讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究 一.化学法 20%(W/V)大肠杆菌悬浮液+B.A 37搅拌 高速离心 测上清液酶活。,1.处理时间 R%2.5h,2.丁酯用量条件：37，搅拌3小时适宜的B.A加量为12%，释放率R=40%,2023/3/9,二.化学法冻融法结合 加B.A(12%,37搅拌3h）菌悬液 冻融(冻结14h，融化)释放率55%；比活2.69 u/mg,三.化学超声波振荡法结合 先丁酯处理，再超声波（90秒），释放率72%，小型设备，不能工业大规模生产。四.高压匀浆法 20%(W/V)菌悬液，P=50MPa，N=

19、3。释放率R=38.4%，原因:细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。,2023/3/9,五.高压匀浆化学法结合 先高压匀浆，再加10%丁酯，37搅拌3h，高速离心(3万rpm)，释放率：R=75%,第三节 破碎率的测定及破碎技术 的研究方向,2023/3/9,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,直接测定法目的产物测定法3)导电率测定法,采用染色法区别破碎的细胞与未破碎的细胞如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与100%破碎

20、率的标准值比较，计算其破碎率。,一、破碎率的测定,2023/3/9,二、破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合,化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。有机溶剂与冻融法、干燥法结合,2023/3/9,破碎技术的研究方向-与上游过程相结合,在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂(如青霉素)，使新生细胞细胞壁有缺陷，利于破碎；选择较易破碎的菌种作为宿主细胞，如革兰氏阴性细菌；用基因工程的方法对菌种进行改造。,2

21、023/3/9,破碎技术研究方向-与下游工程相结合举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶,2023/3/9,（inclusion bodies IBs),第四节 包涵体的纯化,胞外分泌型表达：离心,收集液相浓缩纯化。胞内表达：胞内可溶性表达：离心,收集菌体细胞破碎离心，收集上清纯化。胞内周质表达：离心,收集菌体低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物离心,收集上清液纯化。不溶性包涵体：离心,收集菌体细胞破碎离心,收集沉淀包涵体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。,2023/3/9,生物分离过程的一般流程,本节内容,2023/3/9,外源蛋白在大肠杆菌中的积累,2023/3/9,包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，

22、包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。包涵体的形成的原因？蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态；蛋白质自身不稳定。,包涵体的构成,2023/3/9,基因工程包涵体的纯化方法,收集菌体细胞,细胞破碎,包涵体的洗涤,目标蛋白的变性溶解,目标蛋白的复性,包涵体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的

23、天然活性。,2023/3/9,1）包涵体的洗涤细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。,2023/3/9,2）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。常用变性剂：5-8 mol/L盐酸胍和6-

24、8 mol/L尿素 作用：破坏离子间相互作用 表面活性剂 如1-2 SDS作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度,2023/3/9,原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。复性方法：稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析。,3）目标蛋白的复性,2023/3/9,蛋白质复性影响因素变性剂浓度目标蛋白浓度；pH和离子强度；氧化还原条件。还原剂：二硫苏糖醇、-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；氧化剂：氧化型谷胱甘肽;碱性下通空气。,盐酸胍浓度mol/L,红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响,蛋白质浓度 mol/L,2023/3/9,包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,2023/3/9,作业题,细胞破碎有何意义?常用的细胞破碎方法有哪些?在选择细胞破碎方法时需要考虑哪些因素？破碎率的计算方法？什么是包涵体？常用哪些试剂溶解包涵体？目前包涵体复性的方法有哪些？,