不同亲本数目的中间球海胆群体遗传结构分析毕业论文.doc

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1、毕业论文不同亲本数目的中间球海胆群体遗传结构分析学 生 姓 名： 指导教师： 专业名称： 所在学院： 2010年6月目 录摘 要. IAbstract. II第一章 前 言. 1第二章 材料与方法. 32.1 实验材料. 32.2 实验方法. 32.2.1 DNA提取. 32.2.2 PCR扩增. 32.3 数据统计与分析.5第三章 实验结果. 63.1 微卫星扩增位点分析.63.2 各位点等位基因情况.73.3 遗传多样性分析.9第四章 讨 论. 104.1 海胆幼虫DNA提取方法的优势.104.2 海胆遗传学研究现状. 10致 谢.12参考文献. 13摘 要本实验利用10对微卫星引物，对由

2、不同亲本数目所产生的中间球海胆（Strongylocentrotus intermedius）群体进行了遗传结构分析。实验所用的两个海胆群体分别来源于7个（命名为P7）和3个亲本(命名为P3)，P7群体取100只个体，P3群体取样50只。所有海胆稚胆期采用直接裂解法提取基因组DNA，裂解液直接进行微卫星扩增。结果表明：P3群体扩增出24个等位基因，平均有效等位基因数为1.99750.4209，平均香浓氏指数为0.74210.1984，平均奈氏杂合度为0.47960.1070，P7群体扩增出24个等位基因，平均有效等位基因数为1.97680.5733，平均香浓氏指数为0.72280.2669，平

3、均奈氏杂合度为0.45430.1565；所有遗传学指标在两个群体间没有显著差异。该研究首次建立了中间球海胆稚胆的固定、DNA提取方法并对结果进行了PCR扩增验证，研究结果丰富了中间球海胆分子遗传学内容。关键词：中间球海胆，亲本数目，遗传学，微卫星Abstract10 pairs of microsatellite primers were used to analyze the genetic structure of the two Strongylocentrotus intermedius populations which were produced by different pare

4、ntal numbers. 100 individuals derived from 7 parents (named P7) and 50 from 3 parents (named P3) were subjected to microsatellite analysis. DNA of juvenile urchins was isolated from direct lysis and the lysis buffer were directly amplified. Results showed that: 24 alleles in total were detected in P

5、3 population, the means of effective number of alleles, Shannons index and Neis expected heterozygosis were 1.99750.4209, 0.74210.1984 and 0.47960.1070. 24 alleles were detected in P7 population, the means of effective number of alleles, Shannons index and Neis expected heterozygosis were 1.97680.57

6、33, 0.72280.2669 and 0.45430.1565. All of the genetic indexes between the two groups were not significantly different. This research was the first try of tissue fixation, DNA isolation and PCR amplification of juvenile sea urchin, and the results enriched the content of molecular genetics of sea urc

7、hin.Key words: Strongylocentrotus intermedius, parental stock size, genetics, microsatellites第一章 前 言微卫星标记（microsatellite），又称为短串联重复序列(simple tandem repeats,STRs)或简单重复序列（simple sequence repeats），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由1-6个核苷酸的串联重复片段构成，其长度大多在100bp 以内。微卫星标记是20世纪80年代发展起来的一种能有效区别不同物种、不同群体及不同基因型个体的分子标记技术。具

8、有数量多、在基因组中分布广泛、多态性丰富、突变率高、呈孟德尔式共显性遗传、可以特异性的 PCR扩增、稳定性重复性好、引物通用性好、检测快速方便、能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等优点，在研究物种遗传多样性分析、种群遗传结构分析、种质资源鉴定、基因组作图和辅助育种等方面表现的优越,为水生动物的理论基础研究提供了新的手段。微卫星作为多态 DNA 标记在海洋动物的遗传图谱构建、遗传连锁分析、物种遗传多样性的鉴定、种质鉴定等方面已得到广泛应用。斑马鱼作为脊椎动物发育生物学的模式动物,已经构建了以微卫星为主的遗传连锁图谱;李琪等1采用磁珠杂交选择和 PCR筛选法,从长牡蛎DNA选择片段文库中

9、,快速分离含有微卫星序列的阳性克隆。在筛选的200个白色菌落中,56个克隆含有重复次数5以上的微卫星序列 ,还获得两个小卫星克隆;徐鹏等2还以菌液为模板筛选到中国对虾31个微卫星DNA。Naish等3在鲤科鱼类中分离出5个4碱基微卫星位点,且对野生型和家养型扩增出了多态性。尹绍武等4对海南近海点带石斑鱼野生和养殖群体微卫星多态分析,总体上来看,点带石斑鱼野生群体的等位基因数、平均有效等位基因数、多态位点比例等于养殖群体,而杂合度两个群体相当,说明海南近海点带石斑鱼野生与养殖群体的种质资源都较好,为保护海南近海点带石斑鱼的种质资源提供了分子水平的依据。谭杰等5运用微卫星DNA技术对仿刺参烟台群体

10、、威海群体大连群体的3个野生群各20个个体进行了遗传分析,结果表明威海群体和大连群体之间亲缘关系较近,烟台群体与前两群体亲缘关系较远。杜博等6对皱纹盘鲍和盘鲍南方养殖群体遗传变异的微卫星分析,发现皱纹盘鲍和盘鲍南方养殖群体遗传多样性较高,有利于遗传选育,但与野生群体相比等位基因有所丧失。海胆是一类比较常见的海洋无脊椎动物，其性腺营养丰富，并含有较多的不饱和脂肪酸，具有很高的医疗保健作用，世界上许多地方都有食用海胆的传统。海胆市场价格很高 ,消费量却非常大。为满足人们对海胆的需求 ,世界许多国家如日本、法国、爱尔兰、智利 ,及美国东北部、加拿大的沿海各省以及从北美西海岸的加利福尼亚州到英国的哥伦

11、比亚都进行了过量捕捞7-8,从而 ,人们对海胆养殖的兴趣不断增加 ,海胆的人工养殖和苗种生产的研究逐渐开展起来7,9-11。在海胆养殖及杂交育种等方面，王丽梅等12-13进行了中间球海胆与光棘球海胆的杂交的研究。常亚青等14用中国北部沿海马粪海胆、海刺猬、光棘球海胆三种主要海胆与引自日本的中间球海胆四种海胆之间的不同组合的杂交试验及其子代浮游幼体及幼海胆的早期生长发育。结果表明，采用生殖调控可使不同海胆达到同步繁殖，在8-24下各种海胆杂交组合的受精率与亲本亲缘关系有关，同时受到双亲繁殖适宜温度的影响,受精率介于0-69.6%之间。王吉桥等15于2005年5 - 10月曾进行了不同密度虾夷马粪

12、海胆与仿刺参投饵混养的试验 ,发现在静水精养下混养时海胆的特定生长率(SGR) 和成活率比单养高 ,水质稳定 ,适宜密度为每立方米 44614 g。目前国内、外对海胆形态学、生物化学以及遗传学的研究都有报道16-18，但有关分子标记技术在海胆研究上的应用的相关报道相比较少。Addison 等19 利用4个微卫星标记分析了从大西洋北部至太平洋东北部11个取样地点的绿海胆的遗传结构。 常亚青等20曾利用 RAPD 技术对5种经济海胆基因组多态性进行了分析。丁君等21采用磁珠富集法获得了虾夷马粪海胆的微卫星DNA 序列 ,利用 Premier 5. 0软件设计引物,经筛选,应用其中的12 对微卫星引

13、物获得了 3 个虾夷马粪海胆养殖群体的等位基因频率、等位基因数、杂合度及遗传距离和遗传相似性等遗传参数 , 研究3个虾夷马粪海胆群群体间的差异,发现山东荣成群体与大连 2 个群体间差异较大,群体间存在一定程度的分化 ,将有可能逐渐形成新的地理种群。耿慧君等22进行了 中间球海胆野生和养殖群体遗传结构的微卫星分析，利用 28对微卫星 DNA分子标记对中间球海胆的 1个野生和 1个养殖群体进行了遗传多样性分析。邹林林等23利用cDNA-AFLP技术，对以光棘球海胆()中间球海胆()的F1代为材料，对与海胆壳径、体质量和生殖腺质量等主要经济性状相关的分子标记进行筛选，并对这些数量性状与分子标记的相关

14、性进行分析。结果表明, 10对引物共筛选出与壳径、体质量、生殖腺质量显著相关cDNA-AFLP标记数分别为43、48和42个；极显著相关cDNA-AFLP标记数分别为38、38和23个。本研究采用微卫星标记技术，分析了由不同数目亲本所产生的两个中间球海胆群体的遗传结构，建立了稚胆材料的固定、DNA裂解及PCR技术，丰富了中间球海胆分子遗传学研究内容。第二章 材料和方法2.1实验材料于2008年11月，分别由7只海胆（5雌2雄）和3只海胆（2雌1雄）建立中间球海胆混交家系，分别命名为P7和P3。受精后6个月，在中间球海胆的稚海胆时期，P7和P3家系分别取样50只和100只，用75%酒精固定，24

15、小时后换一次固定液即可，4冰箱中保存，准备进行分子标记分析。2.2实验方法2.2.1 DNA提取1. 将每只海胆分离开来，蒸馏水反复冲洗，分别放入1.5ml离心管中。2. 灭菌后的小剪刀在海胆的壳上剪一个小口，然后加入DNA裂解液(10mmolL Tris-Cl，50m molL KC1，0.5 Tween-20，pH8.0）。3. 加入1l蛋白酶K（0.3mg/ml）4. 55恒温裂解3h后，升温到85保持15min以灭活蛋白酶K。5. 裂解液放入-20冰箱中保存。2.2.2 PCR扩增1.以稚胆的裂解液为DNA模板，进行PCR扩增，PCR反应体系见表1。表1 中间球海胆微卫星扩增反应体系T

16、ab.1 The stock for mocrosatellite in sea urchin反应体系需加体积海胆幼虫裂解液 1ul10buffer 2.5ul引物（10uM）1.0ul/eachdNTP (10 mM)2.2ulMg2+(25mM)1.5ulTaq (5U/ul)0.35ulddH2O15.45ulTotal25ul2. PCR反应条件预变性：94，5分钟；变 性：94，40秒；退 火：退火温度 40秒；延 伸：72，1分钟；循 环：从2到4共34个循环； 72下最后延伸5分钟； 4保存。3. 扩增产物的电泳分离制胶： 30%丙烯酰胺贮备液：丙烯酰胺（Acrylamide）固

17、体 145gN,N-甲叉双丙烯酰胺（Methylene bisacrylamide） 5g加入500ml超纯水，32水浴搅拌溶解备用。 5TBE Buffer（2L）Tris 109gEDTA 9.2gHBO3 55.6g超纯水定容至2L 10%过硫酸铵10g过硫酸铵固体溶解于100ml超纯水中，4避光保存。 TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)，4避光保存。 8%PAGE胶制备30%丙烯酰胺 13.3ml5TBE Buffer 10.0ml超纯水 26.5ml10%过硫酸铵 0.5mlTEMED 50.0l灌胶：8%PAGE胶配置好后，后立即灌胶，室温凝胶1小时以上，胶厚约为1mm。电

18、泳：组装电泳槽，放入缓冲液（1TBE），于200V预电泳20分钟，将PCR产物与3ul上样缓冲液混合，每个点样孔点样3ul，200V电泳2小时。染色和显色： 电泳结束后，将胶取下，用纯水冲洗一次，染液（0.4gAgNO3溶于500ml超纯水）中染色10分钟。 再将胶用纯水冲洗一次。 配置显色液（10gNaOH、0.2g无水Na2CO3溶于500ml超纯水中，加入2-3ml甲醛），将胶在显色液中显色到适合程度为止。 用纯水冲洗，停止染色。2.3数据统计与分析微卫星产物电泳结果经肉眼观察，将每个微卫星位点的等位基因依据片断大小分别命名为A、B、C、按照共显性标记进行基因型统计，带型不清晰或多次扩增

19、未见产物的个体用“.”表示。结果输入Popgene32软件，进行分析。根据Nei法分别求算大小两个海胆群体的基因多样性（Nei指数）：H = (Nei，1974；Nei，1978)。其中qi为第i个位点上的等位基因数，n为检测到的位点数。Ht为种群内总的基因多样性，计算公式为：n为位点总数，和分别为总的种群中I位点上的显性频率和隐性频率。Hs为种群内的基因多样性。Shannon指数(I)的计算公式为：，其中为产物条带的表型。第三章 实验结果3.1微卫星扩增位点分析本实验在Zhou等20开发的中间球海胆微卫星引物中，挑选多态性较好、扩增带型清晰的10对引物，用于中间球海胆稚胆的微卫星扩增及群体遗

20、传多样性分析。引物序列及相应参数见表2。所有引物在P7和P3海胆群体中均扩增出24个等位基因，平均每对引物扩增出2-3个等位基因，片段大小在100-400bp之间。其中引物INTS20在部分海胆个体的扩增电泳结果见图1。表2. 实验所用微卫星引物序列及相应参数Tab.2 Details of microsatellite primers of sea urchin引物名称引物序列（5-3）退火温度（）等位基因数（个）ST52ST21INTS01F:TTTGGGTGGATCCTGTCGTG5922R:TCACAATTCCGTCAGGGCTCINTS02F:TGTATGGTCTGTCGGAAAGC

21、5522R:GATGCAACAATTGACGGAGCINTS04F:GCGATTTGTAAACCTGGGGA5923R:AGGTAGGAGTCATGTCGTCGINTS10F:TGATGGTTTGGGGCATGA5733R:TGGTATGTCGGGAGTGTGAINTS12F:CTAGCGTGTGTCAAGCACG5722R:CGGAGTTGAAGCCGTTGTCINTS14F:GGGAAGTTTTCCCCACTGAC5733R:TGTCCATAACGCCACATTCGINTS19F:TCCATAGCAACCATGCAGC5722R:CCCTCGATAACAGCATCAGCINTS20F:GG

22、TCTACAGACATCCAGTGC5922R:GCAAATGTTCAGGCTTCTGGST16F:CGTAAGAAACTTTTGGGG6132R:CCATACACCATTCAGGCTST24F:TCAGCTATTAGTGCCCTTTT5733R:TGCGAGTGTTTGTTTTGCtotal24243.2各位点等位基因情况两个群体各位点等位基因频率统计结果见表3，基因型频率统计结果见表4。由表可以看出， 等位基因INST02-C，ST16-C在P7群体中出现（f=0.3974和0.4302），而在P3群体中缺失，而INST04-C在P3群体中出现（f=0.0988），而在P7群体中未被检测到

23、。等位基因INST01-A,INST02-B,INST04-C,INST10-A,ST16-B在P3群体中的频率显著高于P7群体中的频率（P0.05），而等位基因INST01-B,INST02-C,INST10-C, INST14-C,INST16-C在P7群体中的频率显著高于P3群体中的频率（P0.05）。表5. P7和P3海胆群体遗传学指标比较分析Tab.5 Statistics of genetic index of eight-armed ST52 puerile sea urchin population群体类型NaNeIObs_HetExp_HetNeiP72.4000.51641

24、.97680.57330.72280.26690.51670.17450.45990.15830.45430.1565P32.4000.51641.99750.42090.74210.19840.62350.14750.48240.10770.47960.1070Na：平均观测等位基因数； Ne：平均有效等位基因数I：平均香浓氏指数； Obs_Het：实际杂合度Exp_Het：期望杂合度； Nei：奈氏杂合度第四章 讨 论4.1 海胆稚胆DNA提取及PCR扩增一般来说，海洋生物DNA提取方法多为肌肉组织“酚-氯仿抽提法”，这种方法需要反复抽提以去除蛋白质，保证DNA的纯度和质量。该过程较繁琐，

25、且经反复抽提，DNA损失量很大。对于成体来说，往往组织量较大，因此可以在一定程度上弥补DNA在抽提过程中的丢失。而对于海洋生物发育早期来说，大多个体组织较小，需要显微观察才能分辨其形态结构，如果采用传统的“酚-氯仿抽提法”，由于DNA大量的损失很难获得足够量的DNA用于后续分子生物学研究。本实验参照前人在扇贝担轮幼虫中的研究报道24，摸索出了适用于海胆稚胆阶段DNA的裂解方法，并将裂解液直接用于PCR扩增模板，进行了微卫星标记的扩增分析，得到了清晰的微卫星扩增带谱。微卫星扩增结果说明该方法可以得到较好的幼虫模板DNA，可以用于后续的分子标记分析。该方法不需抽提可直接用于PCR扩增，不但防止了抽

26、提步骤引起的DNA损失，而且简化了实验过程。另外，该方法不但可以将微小的幼虫阶段纳入到分子标记的研究中来, 便于更全面的掌握海胆整个生命周期内的遗传结构变化动态,扩大了海胆遗传育种学的研究范围和研究内容，也为海胆标记辅助育种等遗传学研究工作提供了早期取样研究的实例，大大简化该方向的研究步骤，且节约了人力、物力及宝贵的时间。4.2亲本数目对海洋生物遗传结构的影响杂合度作为反映群体遗传变异的重要参数，其大小可反映群体遗传变异程度的高低。通常，杂合度高的生物群体更容易适应环境变化，忍受自然选择压力并可能具有更多的优良经济性状。一般认为，用于检测遗传变化的标记在群体中的平均杂合度的范围应该在0.3-0

27、.8之间才有实际意义。战爱斌等检测了仿刺参6个微卫星位点的平均观测杂合度(0.36l1)和平均期望杂合度(0.6412) 25。丁君等研究结果显示，3个虾夷马粪海胆养殖群体的平均观测杂合度为0.4340-0.4618，期望杂合度为0.4494-0.5079，杂合度的平均观察值都低于杂合度的平均期望值，结果显示3个虾夷马粪海胆养殖群体的遗传多样性较低，这可能与海胆养殖群体育苗时所取父母本海胆较少，且进行累代繁殖有关，海胆育苗、养殖过程中的这些问题将导致海胆子代群体中亲缘关系较近，一些杂和位点丢失，建议海胆育苗、养殖单位在较大范围内，选择数量较多的亲本海胆繁育后代，以保证养殖群体的杂和度保持在一个

28、较高水平。本实验所用海胆稚胆群体杂合度水平处于中等，但是用于产生这些个体的亲本数均较少，推测将会存在不同程度的等位基因丢失、杂合度下降等的情况。 万俊芬等26利用AFLP标记技术探讨了不同的交配亲本数对鲍养殖群体遗传结构的影响，结果表明，亲本数少的SS群体的总位点数少于亲本数多的LS群体,后者的一些低频位点在前者中丢失，同时群体的位点频率发生漂移，SS的低频位点数目减少而高频位点略有增加。另外统计了各群体的相似指数和杂合度，发现SS群体的相似指数低于LS,而杂合度高于LS群体。总之，群体的亲本数减少会引起一些低频位点丢失及位点频率发生漂移，同时亲本数过少会导致群体的杂合度暂时升高。Qin等27

29、研究报道了海湾扇贝不同数目亲本所产生的后代的遗传结构变化，发现随着亲本数目的减少，出现了越来越严重的低频位点丢失和杂合度下降的现象。本研究也发现亲本数目较少的P3群体虽然等位基因数量与P7群体相同，但基因型数量少于P7群体。两组之间杂合度尚未出现显著差异，但P3群体杂合度略高于P7群体，推测也出现了杂合度暂时升高的情况，这些研究结果与以上报道相似。随着海胆人工育苗广泛开展，累代养殖和亲本数目较少的情况时常出现，该研究对中间球海胆不同亲本数目所产生的群体进行了DNA直接裂解和微卫星扩增分析，比较了两个群体的基因频率和各遗传学指标，为评价中间球海胆养殖现状以及遗传育种工作提供了基础资料。致 谢本论

30、文从选题的确定，论文的写作、修改到最后定稿都是在指导老师悉心指导下完成的。秦老师多次询问实验进程，帮我分析、解决我在实验中遇到各种难题，不厌其烦，精心点拨，热忱鼓励。秦老师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢两位师兄，感谢你们在实验过程中对我的帮助，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成！ 最后，衷心感谢在校学习期间所有老师对我的栽培

31、、支持和鼓励，感谢我深爱的父母和一直支持、帮助我的亲戚朋友们！衷心地感谢在百忙之中参加此结题报告答辩的各位专家、教授！ 参考文献1 李琪,木岛明博.长牡蛎(Crassostrea gigas)微卫星克隆快速分离及特性分析J.海洋湖沼,2004 ,4(35) :364 - 36912 徐鹏,周岭华,田丽萍,等. 从中国对虾 ESTs 中筛选微卫星标记的研究J.水产学报,2003 ,27 (3) :213 21813 Naish KA ,Skibinski S O. Tetranucleotide microsatellite loci for Indian major carpJ . Journ

32、al of Fish Biology , 1998 , 53 :886 - 88914 尹绍武,廖经球,黄海,等.海南近海点带石斑鱼野生和养殖群体微卫星多态分析J .应用与环境生物学报,2008 ,14(2) :215 - 219.5 谭杰,孙慧玲,刘萍,等. 3个仿刺参地理种群遗传变异的微卫星DNA分析J .水产学报, 2007, 31(4) :437 - 442.6 杜博,龚世园,童馨,等.皱纹盘鲍和盘鲍南方养殖群体遗传变异的微卫星分析J .南方水产,2007 ,3(6) :22 - 29.7 高绪生,常亚青.中国经济海胆及其增养殖M.北京:中国农业出版社,1999.8 常亚青,王子臣,孙

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