基因克隆简介课件.ppt

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1、基因克隆简介,1,一.DNA分子克隆的基本原理,基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。,2,一个完整的基因克隆过程包括以下步骤,.获得待克隆的DNA片段（基因）；.目的基因与载体在体外连接；.重组DNA分子导入宿主细胞；.筛选、鉴定阳性重组子；.重组子的扩增与或表达。,3,1.从生物有机体基因组

2、中，分离出带有目的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,4,5,二.用于基因克隆的工具酶,6,1.1、限制酶概念提出的背景 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，

3、不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。1962年，WArber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，另一种是修饰酶，可对自生的DNA进行修饰。,1.DNA限制性内切酶,7,限制性内切酶,能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。,8,1.2、限制性核酸内切酶的命名原则 限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案，即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写；第2，

4、3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。,9,若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。,如Hind 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac)d株中分离到的第3个限制酶。,10,1.3、限制性核酸内切酶的分类,根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，三大类。I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。类：基因工程的工具酶。类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点25 bp27 bp，对分子克隆操作亦无

5、实用意义。,11,首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。,1.4 II类限制性内切酶,分离的第一个酶是 Hind,12,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,从识别位点处,产生平齐末端,13,（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端。,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3

6、,3-,-5,14,连接便利,（4）粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。,15,16,2.DNA 连接酶,从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。,3.1 DNA连接酶（ligase)的发现,DNA复制一定有断口。,17,（1）大肠杆菌连接酶,1.两种DNA连接酶,只能连接粘性末端。,3.2 DNA ligase的特点,（2）T4噬菌体的连接酶,不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。,18,19,（1）必须是两条双链DN

7、A。,（2）DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+,2.连接条件,20,基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。,三.分子克隆的载体,21,载体具以下特征：1)具有自主复制能力；2）有可选择的标记基因（如，抗药基因）3）有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；4）分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力5）使用安全。克隆载体应只存在有限范围的宿主

8、，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开宿主自由扩散。,22,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,常用的载体有：质粒，噬菌体，粘粒，病毒，BAC，YAC等。,23,1.质粒(plasmid)载体,Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。Plasmid chromosome,24,1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。3、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。4、质粒的不亲和

9、性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。,1）质粒的一般生物学特性,25,（1）分子量大，拷贝数低,2）天然质粒的局限性,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。,（2）筛选标志不理想,ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。,26,第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。,3）发展概况,pBR322质粒是由三个不同来

10、源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。,pBR322质粒,27,28,pBR322质粒载体优点：第一，具有较小的分子量。pBR322质粒DNA分子为4 363bp。第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积10003000个拷贝。这就为重组DNA的制备提供了极大的方便。,29,30,抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板

11、,Tet平板,31,第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的筛选标记基因。如pUC系列载体。,2.7kb,32,Z编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。,lacZ的a肽互补蓝白斑选择原理：,乳糖操纵子,33,异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside：IPTG）结构上类似于别乳糖，是乳糖操纵子非常有效的诱导物。可诱导lac操纵子表达，但不能被-半乳糖苷酶水解。,异丙基硫代半乳糖苷,IPTG,异丙基 硫代-D-半乳糖苷,Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,34,Xgal,（5-Bromo-4-chloro-3

12、-indolyl-b-D-galactoside）,5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖糖苷,35,b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,b-半乳糖苷酶,36,lacZ的a肽互补,1）a-肽（lacZ）：,b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），该段基因序列连接到pUC载体上。,受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成活性酶，不能分解Xgal,37,pUC质粒载体上的lacZ 编码a肽与这个缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又能分解Xgal。产生蓝色物质。,C端

13、大部分,N端的11-41aa,pUC lacZ,受体菌lacZ,载体lacZ与a互补,38,a互补的插入失活,pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。,lacZ,5,3,a肽移码突变,lacZ,5,3,a肽,不互补,互补,MCS,外源DNA,39,通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。,MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。,IPTG诱导的结果：,40,41,第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载

14、体，表达型载体及各种探针型载体。,T7启动子,SP6启动子,MCS,lacZ,Ampr,ori,42,将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。,1）基因文库的构建,（1）基因文库（gene library）,1.目的基因片段的获得,四.DNA 的克隆过程,43,（2）基因组文库的构建,1、提取研究对象基因组 DNA，制备合适大小的 DNA 片段，2、载体DNA的制备；3、DNA 片段与载体连接与包装；4、重组噬菌体侵染受体菌；5、基因文库的鉴定和扩增

15、,44,45,原位杂交，是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。原位杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆，当得到阳性克隆后，再通过 Southern 杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为 9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。,（3）基因文库的筛选,46,原位杂交,47,（1）cDNA,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,（2）cDNA library,2）cDNA文库的构建,mR

16、NA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。,48,（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。,（4）构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（total RNA）提取,（3）cDNA文库的特点,提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。,49,（2）mRNA的分离纯化,50,（3）cDNA的合成,用Oligo dT（或随机引物）作引物，逆转录酶能以RNA为模板合成cDNA。,（4）cDNA与载体连接,

17、在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。,51,52,适用于分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因，同时也可有效地用来分离经特殊处理而被诱导表达地基因。,3）mRNA差别杂交或扣除杂交法分离目的基因,53,4）PCR扩增获得目的基因,PCR(Polymerase chain reaction),聚合酶链式反应是DNA的体外酶促扩增。是利用两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，使目的DNA片段在一

18、定时间以指数方式增加百万倍。,（1）PCR 的概念,54,（2）PCR原理,类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA解离，使之成为单链；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,55,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链每完成一个循环需24分钟，重复循环：变性-退火-延伸三过程，就可23小时

19、就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,模板DNA变性,引物DNA复性,引物DNA延伸,56,57,58,（4）.PCR技术的应用,（1）扩增某一段DNA,从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；cDNA扩增；分析模板序列；,（2）基因的体外诱变,59,2.目的DNA片段与载体分子的体外连接,3.重组DNA导入受体细胞,60,（1）转化（transformation),大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,（3）转染（transfection),大肠杆菌经噬菌体核酸所感染，随后能产生出正常噬菌体后代，叫转染。,1）外源DNA导入细菌的几种方法,（2）转导（transduction),借助噬菌体

20、把外源DNA导入细菌的过程。,61,62,2）.转化方法,（1）热休克法（heat shock）,转化效率高（高于109/gDNA）。,（2）电转化法,简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。,63,10ng载体DNA,100L感受态菌,On ice混合，静置10分钟,42C 1分钟,加入1mL LB培养基,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,热休克法,感受态细胞是指能够结合和摄取外源DNA并发生遗传转化的细胞。,64,1）常用筛选方法,（1）抗药性筛选,（2）营养标记选择,（3）-半乳糖苷酶显色选择反应选择法,2）常用重组体鉴定方法,（1）酶切鉴定,（2）PCR鉴定,（3）杂交鉴定,4.阳性克隆的筛选与鉴定,65,5.目的基因的表达,1）原核表达系统；2）酵母表达系统；3）哺乳动物表达系统；4）植物表达系统。,66,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,筛选阳性克隆,筛选阳性克隆,67,