固定化酶和固定化细胞ppt课件.ppt

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1、主要内容 4.1 酶固定化技术发展史 4.2 固定化酶的定义 4.3 固定化酶的制备方法 4.4 固定化酶的特性 4.5 固定化细胞 4.6 固定化酶与固定化细胞的应用,1916年，Nelson和Griffin用吸附法实现了酶的固定化：将蔗糖酶吸附在骨炭粉上，发现吸附以后酶不溶于水而且具有和液体酶同样的活性。,4.1 酶固定化技术发展史,1953年Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、羧肽酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等酶与这种载体结合，制成了固定化酶。1969年，日本的千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学拆分上，来生产L-氨基酸，开创了固定化酶

2、应用于工业生产的先例。,20世纪60年代后期对酶的固定化研究主要是将酶与水不溶性载体结合起来，称为水不溶酶（water insoluble enzyme）和固相酶（solid phase enzyme）。1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称Immobilized Enzyme。,1973年，日本的千畑一郎等使用固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸，将固定化微生物细胞首次应用于工业生产。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。1978年，日本的铃木等用固定化枯草杆菌生产-淀粉酶，开始了用固定化细胞进行酶的生产先例。1986年，我

3、国科学家利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。,4.2 固定化酶的定义,固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。,固定化酶的优点：,（1）可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低。（2）易与反应体系分离，简化了提纯工艺，产品收率高、质量好。（3）稳定性显著提高，可较长时间使用或贮藏。（4）具有一定的机械强度，可用搅拌或装柱的方式作用于底物液体，便于酶催化反应的连续化和自动化。（5）固定化酶的催化反应过程更易控制。（6）固定化酶比游离酶更适用于多酶体系的使用。,固定化酶的缺点：,（1）固定化可能造

4、成酶的部分失活，酶活力有损失。（2）酶催化微环境的改变可能导致其反应动力学发生变化。（3）固定化使酶的使用成本增加，工厂初始投资增大。（4）固定化酶一般只适用于水溶性小分子底物，对大分子底物不适宜。（5）与完整菌体细胞相比，固定化酶不适宜于多酶反应。（6）胞内酶进行固定化时必须经过酶的分离纯化。,固定化酶应遵循以下几个原则：（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。（2）酶与载体必须有一定的结合程度。（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。（4）固定化酶应有最小的空间位阻。（5）固定化酶应有最大的稳定性。（6）固定化酶的成本适中。,4.3 固定化酶的制备方法,酶的固定化主要方法：吸附法

5、、包埋法、共价结合法和交联法。吸附法和共价结合法又可统称为载体结合法。,4.3.1 吸附法（adsorption）,定义：通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。,定义：通过物理方法将酶直接吸附在载体表面上而使酶固定化的方法。载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉等；无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。,（1）物理吸附法(physical adsorption),优点：操作简单、价廉；条件温和；载体可反复使用；酶与载

6、体结合后，活性部位及空间构象变化不大，固定化酶活力较高。缺点：由于靠物理吸附作用，酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落。常与交联法结合使用。,定义：将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。载体：离子交换剂。阴离子交换剂：二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；阳离子交换剂：羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。,（2）离子吸附法(ion adsorpti

7、on),优点：操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等。此外，吸附过程同时可以纯化酶。缺点：酶与载体的结合不够牢固，易受环境因素如pH、离子强度、底物浓度等影响。,4.3.2 共价键结合法(covalent binding）,定义：将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。酶分子中能与载体形成共价键的基团：（1）酶蛋白N末端的-氨基或赖氨酸的-氨基。（2）酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸的-羧基以及谷氨酸的-羧基。（3）酪氨酸的酚基。（4）半胱氨酸的巯基。（5）丝氨酸、苏氨酸的羟基。（6）组氨酸残基的咪唑基。（7）色氨酸残基的吲哚基。,载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等载体：天然高分子

8、衍生物：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖 合成高聚物：聚丙烯酰胺、多聚氨基酸 无机载体：多孔玻璃、金属氧化物,载体上的功能基团和酶分子上的侧链基团间一般不具有直接反应的能力。通常反应前先使载体上的功能基团活化，再在比较温和的条件下将酶和活化载体偶联。载体活化固定酶法：重氮法、叠氮法、溴化氰法、烷化法,（1）重氮法 将载体活化成重氮盐衍生物，再与酶共价键相连接而固定化的方法。载体：多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。,（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。载体：含有羟基、羧基、羧甲基等基团，如羧甲基纤维素（CMC）、CM-sephadex

9、（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物。,（3）溴化氰法 用溴化氰将含有羟基的载体，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联。载体：具有连位羟基的高聚物，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等。,（4）烷化法和芳基化法 以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。载体：卤素为功能团，如卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。,优点：酶和载体之间的结合相当牢固，酶稳定性好、可连续使用较长时间。缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化。,共价键结合法优缺点,4.3.

10、3 包埋法（entrapment）,定义：将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。,（1）凝胶包埋法 载体：天然凝胶：海藻酸钠凝胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等合成凝胶或树脂：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等。（2）微胶囊包埋法 微胶囊材料：聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素,优点：方法简单；防止酶渗出；酶回收率高。缺点：只适用于小分子底物和产物的酶；高聚物网格或半透性膜对小分子物质扩散的阻力可能导致固定化酶的动力学行为改变和活力的降低。,包埋法优缺点,4.3.4 交联法（cross-linking

11、）,定义：使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。酶蛋白的功能团：氨基、酚基、巯基和咪唑基双功能试剂：戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯和N,N-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等,交联法优缺点优点：结合牢固、稳定性好缺点：酶活力损失大，交联剂价格昂贵,固定化酶不同方法的比较,4.4 固定化酶的特性,4.4.1 固定化酶的形状颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学；酶管机械强度较大，宜用于工业生产。,4.4.2 固定化酶的性质,固定化酶分子状态从游离的状态变为牢固地结合于载体的状态，其结果往往引起酶的性质的改变。,（1）酶活力,固定化酶的活力在多

12、数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；当酶与载体结合时，其构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；酶被固定化后，虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻的影响。,个别情况下，酶经固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。,（2）固定化酶的稳定性,固定化酶的稳定性增强主要表现在：（1）操作稳定性（2）贮藏稳定性（3）热稳定性（4）对蛋白酶的稳定性（5）酸碱稳定性,底物特异性 当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。而当酶的底物为大分子化合物时，固定化酶的底

13、物特异性往往会发生变化。酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。,（3）固定化酶的反应特性,反应的最适pH 酶被固定后，其最适pH和pH曲线常会发生偏移，原因可能有三个方面：一是酶本身电荷在固定化前后发生变化；二是由于载体电荷性质的影响致使固定化酶分子内外扩散层的氢离子浓度产生差异；三是由于酶催化反应产物导致固定化酶分子内部形成带电荷微环境。,反应的最适温度 固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高，会受固定化方法以及固定化载体的影响。,米氏常数 使用载体结合法制成的固定化酶Km有时变动，主要是由于载体与底物间的静电相

14、互作用的缘故。Km值还与载体颗粒大小有关，载体颗粒越小，Km值在固定前后变化越小。最大反应速度 固定化酶的最大反应速度与游离酶大多数是相同的。有些酶的最大反应速度会因固定化方法的不同而有所差异。,4.4.3 固定化酶性质改变的因素,（1）微环境的影响（2）扩散限制、分配效应的影响（3）立体屏蔽的影响（4）酶分子构象改变、化学改变的影响,扩散限制效应：酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散限制：1）外扩散限制是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法

15、可以减少外扩散效应。2）内扩散限制是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散限制的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散限制。,分配效应 由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。,立体屏蔽,固定化后由于载体空隙太小，或固定化的结合方式不对，使酶活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使效应物或

16、底物与酶的邻近或接触受到干扰，不易与酶接触。,固定化细胞的优越性：无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；可进行多酶反应，不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应；对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快。,4.5 固定化细胞,固定化细胞的缺点：必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。,固定化细胞的分类,按细胞类型分：固定化微生物细胞、

17、固定化植物细胞、固定化动物细胞按细胞生理状态分：固定化死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）、固定化活细胞（增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞）,固定化细胞的性质,固定化对酶产生的某些影响对细胞同样有表现，例如增加其稳定性。由于细胞内环境的相对恒定和细胞的缓冲作用，固定化对胞内酶产生的影响不像固定化酶那样明显固定化细胞除了受固定化因素影响外，还受细胞结构及细胞膜透性影响固定化活细胞还要考虑菌体生长、生理生化及它们在颗粒内的分布等问题。,（1）酶活性,固定化细胞的酶活力一般不下降或下降很小与固定化酶不同，还受到两方面影响：一方面，由于细胞壁和细胞膜存在，对底物、产物等效应物的扩散存在障碍，会使酶催化速率

18、下降；另一方面，固定化的生长细胞可以活化增殖，使细胞密度和催化能力有所提高,（2）稳定性,由于载体的缓冲作用，降低细胞对外部环境的敏感性，使固定化细胞的稳定性高于游离细胞。细胞膜的存在可以排除重金属离子、有机溶剂等化学变性剂的作用，保护酶免受剪切力和气泡等机械变性作用，使固定化细胞的稳定性高于固定化酶,（3）反应特性,固定化对细胞的反应特性的影响和固定化酶大致相同。还需考虑到：细胞增殖；细胞壁和细胞膜对底物和产物的扩散障碍；能使大分子转移到细胞内的透性酶的主动转移系统。,4.6 固定化酶与固定化细胞的应用,4.6.1 工业上的应用高果糖浆的生产酒精和啤酒生产L-氨基酸、有机酸的生产6-氨基青霉

19、烷酸（6-APA）的生产,4.6.2 化学分析和临床诊断方面的应用 固定化酶使酶法分析不但显现高度的灵敏性和完全的作用专一性，而且稳定性好，可反复使用，避免由于酶制剂引入的杂质4.6.3 医学方面的应用 将酶制成微小的胶囊型固定化酶再注入人体，可以增加稳定性，且避免与体液接触而产生抗体,4.6.4 亲和色谱上的应用 固定化酶用于亲和层析，可专一性的分离纯化酶的底物、辅酶、抑制剂和抗体等。4.6.5 环境保护方面的应用 一是环境监测；二是污染物处理4.6.6 能源开发方面的应用（1）产生氢气和甲烷（2）固定化微生物电池,4.6.7 基础理论研究方面的应用（1）酶反应机制的研究（2）酶亚单位结构的研究（3）蛋白质、核酸等高分子物质结构的研究（4）揭示酶原激活机理（5）作为膜结合酶的模型（6）生物功能研究,内容回顾,4.1 酶固定化技术发展史 4.2 固定化酶的定义 4.3 固定化酶的制备方法 4.4 固定化酶的特性 4.5 固定化细胞 4.6 固定化酶与固定化细胞的应用,课后思考,1.固定化酶的定义及优点？2.酶的固定化方法有哪些？各有什么优缺点？3.酶固定化后，酶活力降低的原因?4.固定化酶的稳定性增强主要表现在哪些方面？,