申请书编号：.doc

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1、申请书编号：项目类别投送学科代码所属领域指南代码计划项目编号面上农业2103福建省自然科学基金计划项目申 请 书项目名称：青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌GFP标记及其在番茄根际定殖机理的研究申 请 者：车建美 助理研究员工作单位：福建省农业科学院生物技术研究所通讯地址：福州市五四北路247号邮 编：350003电 话：0591-87848933电子信箱：chejm2002申请日期：2005年11月30日福建省科学技术厅二五年填 报 说 明 一、申请项目必须符合福建省自然科学基金资助范围。申请书各项内容，要求实事求是，逐条认真填写，表达要明确、严谨，外来语同时用原文和中文表达。 二、申请书一式六份，采

2、用A4幅面，于左侧装订成册。各栏空格不够时，请自行加页。封面上“顺序号”和“项目编号”申请者不必填写，但“项目类别”、“投送学科代码”和“应用领域”要认真填写。 三、简表的内容应严格按规定填写。凡选择性栏目，请在提示符A、B、C上打“”，其余栏目说明如下：项目名称要确切反映研究内容，字数最多不超过30个汉字（包括标点符号）。所属学科根据申请项目所属学科，严格按国家自然科学基金申请项目分类目录及代码填写。起止年月申请资助年限一般在三年以内，最长不超过五年，起始年月从申请项目年份的五月份算起。申请者如系两人以上联合申请的项目只填写第一申请者情况。所在单位名称须按单位公章填写全称。项目主要研究内容与

3、预期研究成果摘要表述要通俗、精练，总字数不得超过120个汉字，包括标点符号（占一格）。无法用汉字表达的外文用印刷体书写，数字用阿拉伯字，每格2个字符。简 表研 究 项 目名 称类 别A.面上 B.重点 所属领域A. 电子信息 B.农业 C.医药与生物 D.资源与环境E.材料与工程所属学科名称1农学名称2生物学代码1210代码2180起止年限2007年 5月 2010年 5月申请金额 4 万元申 请 者姓 名车建美性别女出生年月1977.11身份证号码371083197711272529学 历研究生学 位硕士授予国别中国职 称助理研究员留学时间年 月 年 月留学国别所 在单 位名称福建省农科院生

4、物技术研究所邮编350002性质 A高等院校 B科研单位 C其他电话0591-87848933项 目 组参加单位数总人数高级中级初级其中博士后博士生硕士生3122主要成员(不含申请者）姓 名身 份 证 号 码职 称所 在 单 位林抗美350102501025032研究员福建省农科院生物技术研究所曹 宜350102197611280320助理研究员福建省农科院生物技术研究所成果摘要120字研究内容和预期利用gfp基因标记的番茄青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌，实时跟踪该生防菌在番茄植株根际和不同土壤条件定殖的数量、时间、空间动态变化及对番茄植株内生菌群落结构和根际土壤微生态的影响，阐明该生防菌的定殖机理

5、和对番茄青枯病抑制效果，为应用提供理论依据。主题词1.主题词数量不多于五个；2.主题词之间空一格一、本研究项目的科学依据和意义（包括科学意义和应用前景，国内外研究概况、水平和发展趋势，学术思想，立论根据，特色或创新之处，主要参考文献目录和出处）（一）科学意义和应用前景1、科学意义1.1 番茄青枯病防治存在的困难青枯病对茄科植物的危害甚为严重，一般田块发病率为2530%，严重田块可达80100%。特别在番茄结果期，适逢高温高湿的雨季，可引起毁灭性的危害。在我国南方各省发生普遍且严重，无特效的化学防治方法（郑福庆，1998），加之化防易产生抗药性，造成环境污染，因此对青枯病菌的生物防治引起了国内外

6、的高度重视，芽孢杆菌、假单孢杆菌和链霉菌等有益微生物及生态有机肥是常被用于青枯病生物防治的重要因子。1.2 生防菌的作用存在的问题生防菌作用效果的不稳定性一直在困扰我们，而要发挥其生防作用的先决条件是必须能在植物上进行有效的定殖。因此，研究并揭示具有生防及促生作用的生防菌在自然界中的生态分布以及在植物体表、体内的定殖、扩展、分布规律，是阐明其生防及促生作用机制并提高其作用效果的重要方面。但是长期以来一直缺乏直观有效的技术手段对其定殖规律及作用机制进行深入的研究，从而制约了其进一步发展。传统的抗生素标记及放射性同位素标记等技术手段受其区分土著微生物和接种物的有效性或者使用的安全性的限制，其使用具

7、有一定的局限性。1.3 基因标记的应用及意义发光基因标记系统的出现为实时、原位监测微生物在环境中的生态分布以及研究微生物和宿主间相互作用机制等提供了一套灵敏可靠的研究方法。其中，绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）标记系统具有基因小（约800bp）、灵敏度高（可检测单个的菌体）、稳定性好，可实时、原位监测等优点，在研究微生物与环境、宿主相互作用，基因表达调控等方面得到广泛的应用，并展现出良好的应用前景。1.4 项目的研究意义项目组在以往的研究过程中，已经获得了大量的关于番茄青枯病方面的资料和基础。从番茄根际土壤分离获得一个生防菌株蜡状芽孢杆菌（Bacill

8、us cereus）ANTI8098A菌株。试验表明，该菌株对福建番茄的田间平均防效为75%-85%。在研究过程中，项目组发现，在番茄根际土壤中存在着蜡状芽胞杆菌和大量的其它芽胞杆菌，这给研究ANTI8098A在根际的定殖带来了困难。目前缺乏蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）在番茄根际定殖的追踪分析，以及与青枯病病原菌生态竞争作用的动态的研究。利用gfp基因标记ANTI8098A及其在番茄根际定殖规律的研究，可以实现生防菌定殖的追踪分析，进行与青枯病病原菌生态竞争作用的动态观察，从而为更加深入地研究番茄青枯病的生防菌防病促生的作用机理奠定基础。2、应用前景研究并揭示具有生防及促生作

9、用的生防菌在自然界中的生态分布以及在植物体表、体内的定殖、扩展、分布规律，是阐明其生防及促生作用机制并提高其作用效果的重要方面。利用gfp基因标记法以实现生防菌定殖的追踪分析，可实现对生防菌定殖的准确灵敏检测；对提高防治水平以及更好利用生物防治措施等将具有重大的指导意义，对开发生物制剂新产品等也将起到推动作用。本项目的研究有助于进一步揭示生防菌与宿主植物内在的相互作用规律，为更加深入地研究植物微生态学打下了坚实的基础。同时，建立一个GFP标记革兰氏阳性的芽抱杆菌的方案。这可能对其它科研工作者也有一定的借鉴意义。（二）国内外研究概况、水平和发展趋势1、青枯病的生物防治现状及存在问题番茄青枯病是由

10、青枯假单胞杆菌（Pseudomonas solanacearum）引起的一种毁灭性的植物病害（郭坚华，1994），在我国南方各省发生普遍且严重，无特效的化学防治方法（郑福庆，1998）。利用微生物特别是芽孢杆菌防治青枯病受到了重视，用于防治青枯病试验的芽孢杆菌有：多粘芽孢杆菌FU6（Bacillus polymyxa）（Aspiras et al., 1985）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）（Phae et al., 1993）、凝固芽孢杆菌BA24 (B. coagulans)、蜡状芽孢杆菌BA3 （B. cereus）（Silveira et al., 1995）、巨大芽孢杆菌B

11、1301（B. megaterium）（杨合同等，2002），等等，试验防效在45-95%。靳绍菊等（1997）报道，通过分析研究，番茄青枯雷尔氏菌的拮抗菌多数属于荧光假单孢菌属。经多次分离筛选，从土壤中分离出了对作物无不良影响而对番茄青枯雷尔氏菌有拮抗作用的菌株104个。经试验，利用这种拮抗菌防治番茄青枯病，当发病株率在25%以下时，防治效果可达100%；但当发病株率达45%时，防治效果仅为50%左右。郑福庆等（1998）从广东省不同地方、不同作物的根围及根际土壤中，筛选到对番茄青枯病病菌具抑菌效果的菌株20个，盆栽试验表明，这些菌株可推迟番茄青枯病发生10-35天，防治效果高达80%。法国

12、Trigalet和 Demery（1990）发现有6个Tn5诱变产生的无致病力青枯突变株，它们能在番茄茎、叶部定殖，它们与强致病菌株以等量或低量接种时，可阻止致病菌的增殖，具有较好的生防前景。Frey等（1996）也得到了相似的结果。项目研究组从番茄病株筛选到青枯病生防菌ANTI-8098菌株，对番茄青枯病有较好的防效（刘波等，2000），经农业部药检所指定的田间药效测定表明：对茄子青枯病的防效在75-85%（未发表），菌株经德国菌种保存中心（DSMZ）鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus，strain ANTI-8098A，鉴定号：ID-01-1000），并对番茄青枯病菌的致病

13、力分化以及生防菌形态特征、生化特性、培养特性、抑菌机理、生产工艺、生物测定、大田试验进行了研究。2、芽抱杆菌在植物病害生物防治中的应用早在1921年，Hartely利用有拮抗作用的真菌防治碎倒病从而开创了植物病害生物防治的先河。1973年澳人利亚植物病理学家Kerr等用放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)K84成功的对一些植物的根癌病进行防治，这使生防菌在防治植物病害中的地位进一步得到确立。目前生产上比较成功的应用于防治植物病害的生防菌有土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽抱杆菌属(Bacillus)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄单孢菌属、假单抱菌属等

14、。其中芽抱杆菌由于能产生抗逆性极强的内生抱子一芽抱，从而更有利于商品化菌剂的生产、运输和保存，并且相对于其它细菌类和真菌类的菌剂其使用效果较为稳定并且与化学农药复配使用的相容性更好。芽抱杆菌属微生物广泛的存在于自然界中，在土壤、植物的根部、植物的体表及体内均分离到大量的芽抱杆菌。目前用生防芽抱杆菌防治植物病害在生产实践中得到广泛的应用。在美国GB03、MBI600、QsT713和FZB24等生防菌株已获得环保局商品化或有限商品化应用许可。GB03和MB160O在根部或拌种使用可防治Fusarium、Aspergillus、Alternaria和Rhizoctonia等引起的豆类、麦类、棉花、花

15、生的根部病害。3、番茄青枯病的发生及其病原菌致病机理的研究 青枯病对茄科植物的危害甚为严重，一般田块发病率为2530%，严重田块可达80100%。番茄在生长过程经常受到青枯病的危害，特别在番茄结果期，适逢高温高湿的雨季，可引起毁灭性的危害。近年来随着大棚番茄的面积扩大，特别是连片大棚番茄的种植，棚内温湿度高，通气条件差，使番茄青枯病在不同地区发生及为害加重。该病害常在开花坐果期发生，来势凶猛，发展迅速，重病田、病株率达80100，初果期发病植株死亡率高，严重威胁大棚番茄生产安全，已成为限制着我国作物生产发展重要因素。青枯雷尔氏菌（Ralstonia. solanacearum）在一般条件下是从

16、植株根部伤口侵入，但不能从植物气孔侵入。病菌进入寄主组织后即可繁殖，并进入维管束，继续向其他组织扩展蔓延，同时分泌果胶酶、纤维素毒等，分解寄主的中胶层，使寄主皮层和髓部组织残废腐烂。寄主组织破坏腐烂后，病菌落入土壤中或堆肥中越冬，来年碰到有利条件，继续侵入寄主为害。4、芽孢杆菌在番茄青枯病防治中的应用前景由于用化学药物难以控制青枯病菌，加之化防易产生抗药性，造成环境污染，因此对青枯病菌的生物防治引起了国内外的高度重视，生物防治可作为解决土传病害的一条有希望的途径。近几十年来，国内外学者已对番茄青枯病的生防做了许多研究。印度Anuratha和Gnanamanikam(1990)用三种菌株Pseu

17、domonas fluorescens(pfcp)和Bacillus spp(B33，B36)分别进行多种作物青枯病的防效试验。其中对番茄青枯病效果，温室试验分别为95、20、33，田间分别为36、3、20。叶云飞等（2005）用不同接种方法测定番茄内生芽孢杆菌B47菌株对番茄青枯病的室内防效，结果表明，接种B47菌17d后再接种茄青枯雷尔氏菌的植株能较好地防治番茄青枯病，防治效果为81.25；B47菌和茄青枯雷尔氏菌同时接种的植株对该病的防效较低，仅为1667。B47菌株与根围链霉菌St103菌株混合施用室内对番茄青枯病的防效为62.52，田间防效为81.82。5、基因标记在植物病害生物防治

18、机理研究中的应用运用现代分子生物学技术基因标记方法，把标记好的生防菌接种植物（一般用绿色荧光蛋白基因进行标记），可以很直观地观察到生防菌是否进入了植物体，不同生防菌的侵染特性及其动力学，侵入部位、在宿主中的定殖部位以及在植物的整个生活史的动态变化，实现研究过程的可跟踪化。利用基因标记研究生防菌的应用已经引起了许多学者的兴趣。Lo等（1998）以葡糖醛酸酶和潮霉素B作为选择标记，用基因枪法进行了T. harzianum 菌株1295-22的遗传转化，并以带标记基因的转化子研究了该菌在匍匐苇草（Creeping bentgrass）根际和叶面的定殖和分布情况。Bae &、Knudsen（20

19、00）以葡糖醛酸酶和绿色荧光蛋白为选择标记，用PEG介导法进行了T. harzianum isolate ThzID1的遗传转化，并用筛选出的带标记基因的稳定转化子检测了该生防菌在土壤中的定殖、生长。Atkins等（2000）以MDPC和绿色荧光蛋白作为选择标记，转化了根结线虫生防真菌P.chlamydospora，但未获得稳定的标记基因转化子。大量的实验表明，借助于GFP标记技术研究细菌的定殖规律具有很多优越性。自1994年Chalfie等首次在果蝇、大肠杆菌等生物体内成功表达GFP起，作为分子标记物，GFP标记技术只有l0年的历史，如今已有越来越多的研究人员将其作为又一快速高效的研究工具。

20、GFP标记在实时、原位研究微生物的空间定位、微生物与环境及宿主相互作用等方面展示了良好的应用前景。6、GFP在微生物与宿主相互作用研究中的应用 早期的研究者用荧光抗体检测宿主中的微生物，后来发明了用荧光染料直接包被微生物以研究其在活体细胞中作用方式。由于这些方法严重影响微生物的生理功能，而且在细菌分裂的过程中荧光信号会不断的减弱，所以很难实现对微生物的长期跟踪。GFP标记系统和荧光显微镜的出现使研究者能够对微生物和宿主相互作用进行长期的、直接的监测。RaPhael等在19%年构建了两套加基因表达系统，分别在鼠伤寒杆菌和海分枝杆菌中高效表达GFP。他们用落射式荧光显微镜对病菌侵染宿主(哺乳动物细

21、胞)的过程进行实时追踪。实验表明，GFP的表达没有对细菌的存活造成不利影响，也没有降低其侵染能力及在吞噬细胞中的存活能力。Qazi等(2000)把从枯草芽抱杆菌中克隆到核糖体识别位点、木聚糖启动子(入ylA)与gfp基因连接，在革兰氏阳性菌中(李斯特单核增生菌、金黄葡萄杆菌、枯草芽抱杆菌等)成功表达出GFP，并对李斯特单核增生菌侵染哺乳细胞的全过程进行跟踪。7、GFP在研究开放环境中微生物的应用近年来，研究人员构建出多种GFP表达系统用于在开放环境中微生物的研究。1996年，Burlage等用Tns转座子将gfp基因插入恶臭假单胞菌的染色体以研究细菌的迁移规律。实验证明，可以用荧光分光光度计精

22、确地检测细菌的迁移率。Eberl等(1997)用gfp基因标记恶臭假单胞菌以研究其在活性污泥中的存活。在接种后，他们很快就观察到在活性污泥絮状物间自由游动的接种菌。两分钟后观察到原生动物捕食标记的细菌。3天后，虽然在絮凝物中有大量的微生物，但是在絮凝物之外却几乎观察不到标记的细菌。这表明絮凝物起到保护细菌不被原生动物捕食的作用。Olofsson等结合使用落射式荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜研究gfp基因标记的大肠杆菌和粘质沙雷氏菌在活性污泥中的定殖。研究发现，菌体表面的疏水性物质是决定其在絮凝物上黏附能力的关键因子；三维的图像显示两种菌在絮凝物上的附着模式完全不同；细菌可以通过孔洞穿过絮凝物

23、。他们的研究揭示了细菌在活性污泥中的附着机制，有助于提高污水处理的效率晰。1999年Unge等使用gfp-lux双标记系统对标记菌的代谢活性和荧光强度同时进行原位检测，展示了双标记系统在环境样本原位检测中的应用前景。这些研究表明，用分子生物学的方法可以清晰的区分接种菌和环境中的土著菌，与传统的抗生素抗性标记相比其灵敏度和精确度要高的多。GFP分子标记法己成为研究微生物在环境中存活、繁殖、扩展以及空间定位的重要手段。但是其样品制备和技术操作也比较复杂，这可能成为妨碍快速分析微生物与环境相互作用的限制因子。（三）项目的学术思想、立论根据1、学术思想1.1为了更加深入地研究生防菌防病促生的作用机理，

24、对其进行GFP标记，并对其在番茄根际定殖机理进行研究。预期可以实现直接观察ANTI-8098A与宿主的相互作用，有助于进一步揭示生防菌与宿主植物内在的相互作用规律，为更加深入地研究植物微生态学打下了坚实的基础。同时，建立GFP标记革兰氏阳性的芽孢杆菌的参考体系。这可能对其它科研工作者也有一定的借鉴意义。1.2利用基因标记法实现生防菌定殖的追踪分析，进行与青枯病病原菌生态竞争作用的动态观察。1.3 利用脂肪酸测定技术研究生防菌ANTI8098A对番茄内生菌的群落结构和动态变化的影响，结合番茄植株抗病性相关酶活性的影响，确定其对植株生长及抗逆性的促进作用。2、立论依据2.1项目组在以往的研究过程中

25、，已经获得了大量的关于番茄青枯病方面的资料和基础。从番茄根际土壤分离获得一个生防菌株-蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ANTI8098A菌株。试验表明，该菌株对野生型青枯雷尔氏菌具有较强的抑制作用，通过农业部指定的福建省农药检定所和上海市农科院植保所田间药效检验，平均防效为75%-85%。2.2在研究的过程中，项目组发现，在番茄根际土壤中存在着蜡状芽胞杆菌和大量的其它芽胞杆菌，这给研究ANTI8098A在根际的定殖带来了困难。目前缺乏蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus，ANTI8098A）在番茄根际定殖的追踪分析，以及ANT-8098A与青枯病病原菌生态竞争作用的动态的

26、研究。利用基因标记法和盆栽试验，根据标记基因实现生防菌定殖的追踪分析，进行与青枯病病原菌生态竞争作用的动态观察，可以更加深入地研究生防菌防病促生的作用机理。2.3现代分子生物学技术为生防菌的准确灵敏检测提供了理论基础和操作手段。本项目研究的申请者曾在瑞典农业大学微生物系，在著名科学家JANET教授指导下，进行了不同菌株的GFP转化研究，具有较为丰富的研究经验，成功地进行了青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、大肠杆菌K88（Escherichia coli K88），短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）等的标记，并获得稳定表达菌株，实现研究过程的可跟

27、踪化。并在生防菌蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus，ANTI8098A）GFP标记上取得重要进展， 2.4利用微生物膜间脂肪酸组成特征，可在大量的微生物样品中准确到地鉴定到种，同时，可将其应用于植物和土壤菌群落动态变化及生防菌生防机制的研究。本项目组已利用该技术对分离到的生防菌和青枯病病原菌进行了脂肪酸特异性分析。（四）项目特色和主要创新点1. 利用gfp基因标记，实现生防菌ANTI8098A定殖过程以及生防作用过程的追踪分析，进行与青枯病病原菌生态竞争作用的动态观察，可以更加深入地研究生防菌防病促生的作用机理。2. 利用微生物膜间脂肪酸组成特征，利用脂肪酸测定技术，分析植株和土壤菌

28、群的群落结构及动态变化；3. 揭示生防菌ANTI8098A与宿主植物内在的相互作用规律，为更加深入地研究植物微生态学打下了坚实的基础。（五）参考文献：见附件参考文献1) Yi, Y.K. 1991. Protection of tobacco plants from bacterial wilt with avirulent bacteriocin-producing strains of Pseudomonas solanacearum. Journal of the Korean Society of Tobacco Science. 13:42-47.2) Hara, H., and K

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30、cteristics in Taiwan. Bulletin of Taiwan Tobacco Research Institute, Taiwan Tobacco and Wine Monopoly Bureau:53-60.4) Chen, Y., Y. Ye, D. Hong, W. Zhuang, Y.S. Chen, Y.X. Ye, D.Z. Hong, and W.D. Zhuang. 1999. Characterization and evaluation of groundnut germplasm in Fujian. Journal of Fujian Academy

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