外源基因表达与基因工程药物1.ppt

《外源基因表达与基因工程药物1.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外源基因表达与基因工程药物1.ppt（92页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第十章,外源基因表达与基因工程药物,2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿,我国约6000万。治疗糖尿病特效药胰岛素。每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,基因工程方法生产蛋白质药物的优势是非常明显的,23 万美元/病人 200300 美元/病人,胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素 EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体,基因工程的产物：,思考：基因的表达与基因的什么过程有关？,密码子在

2、生物界是的！,通用,基因表达,指基因通过转录和翻译而产生其蛋白产物，或转录后直接产生其RNA产物的过程。,外源基因表达,利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成mRNA，进而翻译成肽链或加工成活性蛋白质的过程。,学习要求,掌握：基因表达的基本原理，外源基因表达的基本过程。熟悉：外源基因表达的基本类型，外源基因表达载体的基本组成与功能。了解：外源基因表达在生产基因工程药物中的应用。,指在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体（宿主）细胞内使之持续稳定繁殖，目的基因扩增、表达，获得人类所需的产品的工程。,（一）外源基因表达（基因工

3、程）的概念,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。,又称为基因克隆（gene cloning）或分子克隆（molecular cloning）。克隆（cloning）：指无性繁殖系，即由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。,外源基因表达基本类型,根据宿主细胞不同：原核细胞表达系统；真核细胞表达系统。根据表达产物在宿主细胞生成的部位不同：胞内表达、定位表达、分泌表达。根据表达产物的溶解状况不同：可溶性表达、包涵体表达。根据表达产物的结构状况不同：非融合表达；融合表达。,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,外源基因表达（基因工程）的基本过程：,（1）分离：提取

4、和获得目的基因和载体DNA；（2）切割：分别对目的基因和载体DNA酶切；（3）连接：用DNA连接酶连接目的基因与载体，形成 新的重组DNA分子；（4）转化：用重组DNA分子转化受体（宿主）细胞；（5）筛选：重组体在受体细胞中复制和遗传；对转化 子筛选和鉴定；（6）表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培 养，获得所需的遗传性状或表达出所需要 的产物。,基因工程的重大意义1)重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。,（2）利用重组DNA技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构

5、、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。,（3）医学上应用更为广泛，涉及各领域正常人类生命活动的分子机制；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病、传染病等病因的 查明、诊断、治疗和预防。药物的研发和生产；疾病模型的建立；人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）,本章节的地位：,现代科技革命,高新技术,生物技术（生物工程）,基因工程,基因克隆,分子遗传学理论上的六大进展解决了生命现象的遗传物质基础（均是核酸）结构模型（同类构件、双螺旋）复制方式（相似的机制）遗传信息流动方向（共同的中心法则）遗传密码（共用一套相同的密码）表达和调控的机理（类同的方法）

6、基因突变机理、意义（变异与进化）为基因工程技术的诞生典定了理论基础。理论上的可行性。,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,艾弗里证明DNA是主要遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因

7、工程,早期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,克里克等提出中心法则,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,二、分子遗传学新方法是基因工程的技术基础首当其冲的是要解决：如何自如地得到目的基因；如何在体外改造基因，得到重 组体；在体外转移重组基因；直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。,基因操作的工具,一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(N

8、athans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE),是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶,限制酶（型）,特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断回文序列：是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;,限制性内切酶能识别特定的碱基序列,限制性核酸内切酶,命名：大肠杆菌：Escherichia coli；EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发

9、现次序)；流感嗜血菌：Haemophilus influenzae;HindIII,2.同裂酶(异源同工酶)：凡来源不同但识别和切割同样的核苷酸序列的限制性酶。3.同尾酶：来源、识别顺序、切割方式不同，但所生成的限制性片段是相同的粘性末端,限制酶切出的末端,粘性末端（sticky end）:两条链上的断裂位置是交错的、但又是围绕着一个轴线对称排列，其结果产生两个互补的单链末端，这种单链末端由于可以互补成双链结构，所以称为粘性末端。平末端（blunt end）:在识别序列内同一位置上的核苷酸处进行切割，产生的DNA片段不带粘性末端而是没有单链突出的平齐末端。,作用特点断开磷酸二酯键,EcoR,黏

10、性末端,黏性末端,作用特点断开磷酸二酯键,Sma,平末端 平末端,限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的构建,“分子缝合针”DNA连接酶,3,作用原理：催化磷酸二酯键形成,1.Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,2.T4DNA连接酶,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,3.连接酶类型总结,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,比较：DNA连接酶与DNA聚合酶,1)

11、只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,DNA限制酶和连接酶的发现使基因工程从理论走向了实验室,大多数的DNA片段不具备自我复制能力，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，就必须将DNA片段连接到一种具有自我复制能力的DNA分子上，这种DNA 分子就是载体。,载 体（Vector）,载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具，其化学本质为DNA。常用的载体

12、分为3类：质粒、噬菌体和病毒,作为载体的条件,能独立复制具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)具有遗传表型或筛选标记有足够的容量以容纳外源DNA片段。表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。,常用的载体有：1.质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的、能自主复制的环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。2.噬菌体DNA线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。,大肠杆菌的质粒载体,氨苄青霉素抗性基因：ampr；四环素抗性基因：tetr；DNA复制起点：ori,返回,用质粒构建重

13、组DNA分子,噬菌体,组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。,用噬菌体DNA构建重组DNA分子,以扩增DNA片断为目的，并不需要得到目的基因所编码蛋白质的载体，适用于外源基因的重组、克隆、复制与保存；克隆载体常带有一个松弛型复制子，一个多克隆位点、筛选标记,分类：质粒、噬菌体、黏性质粒、M13噬菌体、酵母载体、真核细胞病毒载体,质粒和噬菌体常用于原核细胞为宿主的分子克隆，病毒则使用于真核细胞为宿主的克隆,能使外源基因在宿主细胞 中转录和表达的功能性载体。,item,Click to edit tex

14、t,Click to edit text,1.很强启动子，能被宿主RNA聚合酶识别,2.很强终止子,3.启动子只有在诱导状态时才能启动转录,4.起始密码和SD序列处在合适距离,5.需复制原点，在载体内插入人工组成的多克隆位点,具备条件,宿主（host）,能接纳重组子并实现重组子的外源基因转录、扩增或表达的受体细胞。原核细胞：大肠埃希菌、芽胞杆菌等。属于原核细胞表达系统。真核细胞：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。属于真核细胞表达系统。,1972年，美国斯坦福大学Berg博士领导的一个研究小组，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，基因工程从此诞生。,目的基因,基因载体,重组体,分,切

15、,接,转,筛,表,总体技术路线,基因工程的主要步骤,1.从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段-目的基因的获得。2.将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子-DNA分子重组。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞内-导入。4.筛选获得了重组DNA分子的受体细胞进行克隆-分子克隆。5.克隆基因的表达，产生出人类所需要的物质-基因表达。,1.目的基因制备和常用分离方法,目的基因：指已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。通常是人们需要的生物活性物质的编码基因。,目的基因的获得,概述：1979年采用化学方法合成基因；只要合成

16、出具有特定序列的寡核苷酸片断，通过DNA连接酶的作用，可使其 按照一定的顺序进行共价连接而成,“I do my best thinking while driving”,1993 Nobel prize,聚合酶链式反应:利用酶促反应在体外大量、特异性扩增DNA片段。把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。,three steps:,How PCR works,Denaturation(变性):9097,Annealing(退火):4555,Extension(延伸):around 72,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,3.外源DNA片断导入受

17、体（宿主）细胞,构建好的重组 DNA 分子进入宿主细胞的过程，称为转化。如果接受异源 DNA 的细胞不是细菌，而是动物细胞或植物细胞，常常称为转染。,重组DNA导入大肠杆菌细胞 氯化钙转化法 转染法,4.筛选目的基因,目的基因导入受体细胞后，还需要经过筛 选，才能确定真正所需要的目的基因。根据载体的选择性标记基因的生物活性表现状况进行初步的甄别和筛选。用PCR技术扩增进一步检测。通过基因测序分析确证。,标记的DNA探针,5.基因的表达,克隆基因表达的三个条件：基因的编码区不能被插入序列所中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA多聚酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被

18、翻译，产生的外源蛋白质必须不被宿主细胞的蛋白酶所降解.,小结,基因工程主要包括几个过程：1、目的基因的制备；2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连 接生成重组DNA分子；3、将重组DNA片段导入宿主细胞；4、筛选目的基因；5、目的基因的表达,基因工程的应用,基因工程药物制备疫苗基因治疗转基因动物转基因植物工程菌,1、基因工程药物,生产基因工程药物的基本方法是，将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物，哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及作成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。,2、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以

19、帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。,常见的基因工程药物,干扰素系列，肝炎病毒复制抑制、肿瘤治疗 白细胞介素系列 肿瘤、免疫增强 EPO（促红细胞生成素）促进红血球增生、治疗贫血 G-CSF 促进粒细胞增生 TPO 促进血小板生长 EGF 促进表皮细胞生长 NGF 促进神经细胞生长 单克隆抗体系列 基因工程疫苗,基因工程的安全性和社会伦理问题,科学技术 是一

20、把双刃剑，带来巨大利益，同时也带来了潜在威胁和社会伦理问题。,基因工程的发展离不开社会伦理道德的制约。,思 考 题,1.名词解释：基因工程、克隆载体、表达载体 2.基因工程的内容和步骤是什么？3.基因工程的载体具有哪些特点？,Thats AllThank you!,哈哈，下 课 了!,基因工程生产胰岛素的原理（示意图）,DNA连接酶,连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）不是氢键（梯子的踏板）,原核生物的限制-修饰现象,1.2 未知基因的获得,基因组文库（genomic library），也称为基因文库（gene library）。包含某种生物整个基因组序列（外显子和内含子）的重组DNA克隆群体

21、。,基因组文库构建,基因文库构建流程图,基因组文库的制备步骤：1.纯化全细胞DNA；2.部分限制性酶切得到适当大小的片段；3.插入到合适的载体上；4.转化受体菌，获得含不同DNA片段的克隆群。5.重组DNA的筛选和鉴定。,cDNA文库（cDNA library）：利用纯化的细胞和组织总RNA，在逆转录酶作用下合成互补的DNA及cDNA（complementary DNA），构建cDNA序列的重组DNA克隆群体，是具有表达功能外显子序列的总和。,cDNA文库构建,cDNA文库的构建过程：mRNA的提取及其完整性的确定；cDNA的合成和克隆；目的cDNA的鉴定等步骤。,方法：合成cDNA第一链 5AAAAAA 3 mRNA TTTTTTT 5 cDNA 1 Oligo(dT)，反转录酶 d NTP,合成cDNA第二链 AAAAAA 3 cDNA 2 TTTTTTT 5 RNase H，DNA聚合酶,dNTP 5 AAAAAA 3 双链 cDNA 3 TTTTTTT 5,（1）获得目的基因，DNA的提 取、纯化和DNA分子的克 隆，建立文库。（2）制备活性多肽产品：激素、细胞因子、多肽药物疫苗 等，诊断和防治疾病。（3）研究基因结构、功能等,基因工程的目的,