第十六章分子流行病学.ppt

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1、第十六章 分子流行病学Molecular Epidemiology 1.概述 2.研究内容 3.研究方法 4.发展与应用前景,Contents1.Introduction2.Research methods3.Brief introduction to common laboratory techniques4.Utilization of molecular epidemiology5.Example for molecular epidemiological researches6.Prospect(look into the future),Section one Introducito

2、n,一、分子流行病学的产生与发展历程 Progress of molecular epidemiology（一）背景 分子生物学技术的不断发展：1分子流行病学的研究方法越来越多：如在分子流行病学产生的初期，主要研究手段是质粒图谱分析、核酸杂交等技术，且程序烦琐、费事费力，目前许多新的技术已应用于分子流行病学研究，且可自动化或半自动化测定，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）、DNA序列分析、酶定量分析等等。2研究内容越来越多：已从研究传染病的病原体、传染源、传播途径，逐渐延伸至非传染性疾病或健康状态，以及人群易感性和疾病预防、治疗措施的评价等等。3应用范

3、围越来越大：从预防医学到整个生命科学。,（二）发展历程 1.概念的演变：近20年来分子生物学被引入流行病学研究领域。使流行病学研究中的组间比较更为准确；对发病机制的认识更为明确；对暴露与疾病发生过程的研究更为精确。目前，分子流行病学成为现代流行病学的一个重要组成部分。,最早使用“分子流行病学”这一术语的是Kilboure，他于 1972年用分子生物学技术探讨了流感病毒抗原变异与流感大流行之间的相互关系，旨在通过研究病毒分子结构，来阐明流感发生大流行的原因。但作者并未解释“分子流行病学”的涵义。之后有关学者相继使用这一术语，不断有一些解释。,1993年Schulte出版了第一部分子流行病学专著，

4、并给分子流行病学定义为，“在流行病学研究中，应用生物学标志物，包括生化的、分子的、生理学的、免疫学的、遗传学的等信号，这些事件信号代表致病因子与所致疾病之间连续过程中一个个相关的环节。”,2.血清流行病学定义 血清流行病学(seroepidemiology)是应用血清学方法检测人群中特异性抗原、抗体、各种代谢产物、遗传标记、生化指标、营养成分等血液成分，借以了解疾病或健康状况在人群中的分布及其影响因素，探讨疾病发生的原因并评价预防措施的效果。血清流行病学是流行病学的一个重要分支之一。,血清流行病学有狭义和广义之分。而广义上的血清流行病学实际上由于分子流行病学的迅猛发展，已逐步融入分子流行病学之

5、中，实际上已属于分子流行病学的研究范畴。所以，我们不再将血清流行病学单作一章介绍，而是并于分子流行病学这一章中一并介绍，更具实际意义，也更有助于读者对分子流行病学的理解。,二、分子流行病学的定义 Definition and progresses of molecular epidemiology（一）分子流行病学的概念 Definition of molecular epidemiology 分子流行病学(molecular epidemiology)是应用分子生物学的基本理论和技术，研究疾病或健康的人群现象。它从分子水平揭示影响疾病或健康分布的因素，为更有效地控制疾病和促进健康提供基因或分

6、子水平的研究方法和防治手段。,Molecular epidemiology is a branch of epidemiology that combines theories and methods in both epidemiology and molecular biology.What defines molecular epidemiology,as opposed to conventional epidemiology,is its use of biological and in particular genetic markers as a measure of the p

7、ropensity of developing a disease or as an indicator of a disease or an exposure in the study of the distribution and cause of disease.,Molecular epidemiology has the same objectives as conventional epidemiology:to study the occurrence,development and prognosis of disease,to evaluate the effectivene

8、ss of preventive and therapeutic interventions,and to provide essential evidence for clinical and healthcare decision making.,三、与传统流行病学的关系 Relationship between conventional and molecular epidemiology 分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间的“黑匣子”之谜。,Conventional EpidemiologyExposure DiseaseMolecular Epidemiology,暴露标志 疾病标

9、志暴露 内剂量 生物学 早期生物 结构和 临床疾病 预后意义 效应剂量 学效应 功能改变 易感性标志 传统流行病学与分子流行病学的关系,Section two Research Content,一、生物标志种类暴露生物标志(exposure biomarker)定义与疾病/健康状态有关的暴露因素的生物标志 外暴露标志(external exposure marker,EEM)内暴露标志(internal exposure marker,IEM)生物作用标志(biologically active marker,BAM),效应生物标志(effect biomarker)定义指宿主暴露后产生功能或

10、结构性改变的生物标志 早期生物效应标志(early biological effect marker,EBEM)结构和功能改变标志(altered structure and function marker,ASFM)病理标志(pathological marker,PM)临床疾病标志(clinical disease marker,CDM)健康状态标志(health condition marker,HCM),易感性生物标志(susceptibility biomarker)定义指在暴露因素作用下，宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志易感性 与宿主的遗传特征、生长发育、营养等有关。宿主在不

11、同疾病阶段，可以具有不同的易感性标志。,生物标志选定 生物标志的筛选 研究目的 候选生物标志特征的意义 检测方法的有效性,生物标志特性 分子特性 时相特性 个体内变异 个体间变异 群体间变异 储存变异,检测方法 实用性 可信性 有效性 灵敏度、特异度,常用的生物标志传染病生物标志,表16-1 传染病研究常用的生物标志,慢性非传染病的生物标志,表16-2 慢性非传染性疾病常用的生物标志,二、暴露测量 外暴露研究,检测鉴定生物性病原因子 流感嗜血杆菌 研究病原生物进化变异规律 o157大肠杆菌确定传播途径 S.munchen菌感染 测量非生物性因素暴露 吸烟烟雾,内暴露研究传染性疾病 人体感染状况

12、 追踪传染源慢性非传染病 内暴露水平 生物作用水平,三、效应测量,传染病 慢性非传染病 健康状态,免疫效应病理性效应,基因表达和代谢异常 基因突变或染色体畸变,四、易感性测量,遗传性疾病 Huntington病应用分子流行病学方法很快确定了HD基因紧密连锁遗传位点D4S10及其DNA标志 慢性非传染病 载脂蛋白E(apoE)不同基因型在动脉粥样硬化和冠心病发病中易感性不同传染病 不同基因特征的人群对HIV的易感性差异很大,传染病 预防接种效果评价 预防接种相关疾病研究慢性非传染病,五、疾病防治效果评价,潜隐期长多影响因素,Section three Research methods,一、生物标

13、志的确定与标本采集 Determination of biomarkers and collection of specimens（一）生物标志的确定(determination of biomarkers)生物标志(biomarker)分为三大类，即暴露标志(exposure marker)、效应标志(effect marker)和易感标志(susceptibility marker)。这三类标志只不过是些笼统指标，具体到某一种疾病或健康状况，应根据研究内容与目的确定与之密切相关连的具体标志。,1.暴露标志的选择(selection of exposure markers)应选择那些最具代表

14、暴露剂量而又十分客观、稳定、敏感、特异的标志。暴露标志是指那些与疾病或健康有关的暴露因素的 生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。外暴露标志(external exposure marker)：暴露因素进入机体之前的标志，如病毒、细菌、支原体等微生物及毒素、粉尘、烟雾、化学致癌物等。内暴露标志(internal exposure marker)：暴露因素进入机体之后的标志。,2.效应标志的选择(selection of effect markers)机体在暴露于有关危险因子以后到疾病发生这期间，会产生与之相对应的生物学效应(biological effect)或称为生物学反应(biologic

15、al response)。因此，可以产生功能性或结构性变化的生物标志，如发生变异的基因、产生的特异性产物等。应选择那些最能代表生物学效应实际情况的标志，且同样应具特异、敏感、简便等优点。,3.易感标志的选择(Selection of susceptibility marker)易感标志是指机体对疾病发生、发展易感程度的生物标志。在确定易感人群时，通常选择免疫学指标和易感基因作为易感测定标志。,（二）标本的采集(Collection of specimens)标本的采集、运送和储存是实验室分析的第一步，也是很关键的一步。为了采集高质量的标本，应注意以下几个问题：,1.采集最适标本(Collect

16、ion of optimal specimens)首要问题是有的放矢，一般根据已有流行病学资料和疾病的临床表现进行分析，初步推断可能是哪类疾病，再根据发病规律和病程决定采集何种标本。可以从以下几个方面考虑取材部位：从病原体入侵部位取材；从病原体感染的靶器官取材；根据病原体的排泄途径取材；非传染性疾病主要从受损组织取材或其它能反映效应指标的标本；直接采集病原标本。此外，根据疾病的种类、病情采集标本。有的疾病需要在发病的早期采集标本，有的则需要在早期和晚期采集标本。,常采集的标本有：病原体标本；体液标本，如血液、尿液、胃液、精液、分泌物等；组织标本，如机体各种组织、毛发、媒介体等。,2.标本的运送

17、与储存(Transport and storage of specimens)标本采集后应尽快送往实验室，马上检测最好，如不能马上进行应注意适当保存。根据情况可采取冷冻、冷藏运输，以保持活性。采集的标本应放入适当的容器，以不易损坏和泄漏，特别是烈性病原体标本，应加金属套罐，派专人专车运送。采集的标本除了防止扩散，也应防止被污染包括生物性的、化学的或其它标本的污染。采集的标本储存后应不影响检测结果，即在任何时间检测都可获得一致的结果。所有的标本都应有详细的记录和标签等。,二、常用实验室方法(Common lab methods)（一）核酸研究方法(Research methods of nucl

18、eic acid)随着分子生物学和分子遗传学的发展，人们清楚地了解到生物的任何性状（表型）是由于其本身的遗传物质 核酸（DNA或RNA）所决定的。对于核酸的分析最能客观地反映各种生物现象（效应）的本质。,1.核酸中碱基含量的测定(Assay of basyl content in nucleic acid)常用的是G+C含量的测定。亲缘关系近的病原体，它们的G+C含量相同或近似，亲缘关系远的病原体，它们的含量不同。因此，可用于传染病传染源和传播途径的分析。但在某些情况下，G+C含量相同或近似的病原体其亲缘关系不一定近似。因为上述分析只反映了核酸的核苷酸组成，并不能反映核苷酸序列。,2.核酸电泳

19、和限制性内切酶图谱分析(Nucleic acid electrophoresis and restriction enzyme analysis)某些病原体，如引起腹泻的轮状病毒，它们的核酸是分节段的，直接提取核酸即可进行琼脂糖凝胶电泳，产生特定的电泳带，每一型的轮状病毒的电泳带具有特定的数目和大小、分布特征等。其它大多数病原体或生物标本的核酸，可用限制性内切酶酶切消化以后，再进行电泳分析，不同的病原体或生物标本产生不同电泳图谱。,图2 T-A克隆后酶切鉴定结果 Fig 2 Enzyme digestion analysis of T-A control clone fragment of J

20、R23 strain,3.核酸杂交(nucleic acid hybridyzation)核酸杂交需要一个探针(probe)，即一种标有示踪分子的特异单链 DNA 或 RNA分子，这种探针可与待测标本中的特异性序列结合。常用于生物标本中病原体特异核苷酸序列的检测。常用的有斑点杂交、原位杂交、转印杂交等方法。,4.寡核苷酸指纹图(oligonucleotide finger printing)病原体或生物标本的核酸经特定的酶消化后，可进行双向电泳，然后再进行放射自显影，显示出一定的图谱特征，称为指纹图(finger printing)。此图谱具有特异性。常用于微生物同源性分析。,5.质粒图谱分析

21、(plasmid figure analysis)不同的细菌的质粒DNA不同，因此可对质粒DNA进行酶切反应、电泳、图谱分析。常用于微生物同源性分析。,6.PCR(polymerase chain reaction)PCR是一种80年代初发展起来的一种高效体外基因DNA扩增技术，需要一对寡核苷酸引物（上游和下游各一），在耐热的DNA多聚酶的作用下，合成特异的DNA序列，包括高温变性、低温退火、中温引物延伸三个步骤，这三个步骤反复循环，在短时间内可扩增至几百万倍。此法具有高度特异、敏感、快速、简便等优点。常用于基因扩增、克隆、标本中特异性核苷酸序列检测等。,7.DNA序列分析(DNA seque

22、ncing)DNA序列分析有了很大的发展，常用双脱氧末端终止法。由于与计算机相结合产生了自动化分析仪，使核酸序列分析变得非常简便、快速、准确、可靠。该方法是所有核酸分析技术中最可靠的一种方法，可用于任何来源的两个或多个DNA片段之间核苷酸序列的比较。所以，是追踪传染源、分析传播途径、阐明流行规律十分可靠的分子流行病学方法。,8.单链构象多态性分析(single-stranded conformation polymorphism,SSCP)是将基因扩增产物变性为单链核酸，然后进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），观察区带的迁移率。由于迁移率与核酸的构象密切相关，只有一个核苷酸的突变就可以

23、改变分子构象，因而表现在电泳迁移率上的差别。此法可以检测基因突变。但不能确定基因变异的位点及方式，最后还需要进行序列测定。SSCP可用于病原体和生物标本的研究。,9.基因定点突变技术(Site-directed mutagenesis)此技术可随意在克隆的基因上进行突变，然后测量突变后基因功能的改变。常用于基因结构与功能的研究。,（二）蛋白质研究方法(Research methods of proteins)只要有蛋白质在，就有基因在，蛋白质是基因表达的产物，几乎所有生物体都具有蛋白质，包括结构蛋白和功能蛋白。对蛋白质进行研究分析，实际上是间接地对其相对应的基因进行分析，因为蛋白质的氨基酸（a

24、a）顺序是由相对应的核苷酸顺序决定的，因此蛋白质分析也具有特异性。蛋白质技术包括PAGE、肽图分析(peptide mapping)、转印技术、色谱技术、测序技术等。,（三）酶学技术(Enzymatic techniques)大多数酶属于蛋白质，因此可以用分离蛋白质的方法分离酶，并可在特定条件下定性、定量测定其活性，同样也可以测其分子量。,（四）免疫学技术(Immunological techniques)分子流行病学的研究中，常用分子免疫学标记技术，如酶标记（EIA）、荧光标记（FIA）、放射标记（RIA）三大标记技术。单克隆抗体（McAb）技术的应用为免疫学技术开辟了新的天地，不仅可以用于

25、疾病的诊、治，还可用于病原体同源性分析等。,（五）生物芯片技术(Biochip techniques)生物芯片(biochip)技术是近几年才发展起来的一种基于分子杂交原理的检测技术。它是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型分析系统，以便对细胞、蛋白质、基因或其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。与传统的仪器检测相比，生物芯片有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等优点。目前最成功的是基因芯片。,（六）其他技术(other

26、 techniques)分子流行病学应用的实验室技术很多，除了上述介绍的技术外，还有各种色谱技术、毛细管电泳技术、其他理化分析等实验室技术。当然分子流行病学研究方法也离不开传统流行病学的现场流行病学研究方法，即描述性、分析性、干预性研究等（见有关章节）。传统流行病学研究方法结合生物学标志检测，从分子或基因水平更深一层次揭示病因、致病机制等，是当前常用的分子流行病学研究模式。,三、研究设计要点(Key points for research design)分子流行病学研究设计，是在传统流行病学研究设计的原理和模式的基础上，再考虑分子生物学技术或生物学标志的应用带来的有关问题。生物学标志是指代表生

27、物生理、组织、细胞、亚细胞以及大分子的可识别物质。如前所述，分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间的“黑匣子”之谜。因此，在进行分子流行病学研究设计时，首先应按照传统流行病学研究设计的一般要求，如明确的研究目的，选择有代表性的样本及数量，各种对照组的设置，对照组和实验组的可比性、方法的准确性、合适的资料统计分析方法、偏倚的控制等。这些是流行病学研究的最基本要点，如果脱离这些要点，即使在研究中使用了先进的实验室技术，也得不到准确的研究结果。,以下几点供进行分子流行病学研究设计时参考。（一）明确研究目的 进行研究设计时首先要明确该研究要解决的问题，确实做到有的放矢。（二）选择客观准确的测定指标 研究

28、中所选择的各种“标志”，必须是客观的、稳定的和有代表性的测定指标，并且容易检测到。生物学标志的选择是否恰当，决定着分子流行病学研究的成败。,（三）选择科学的测定方法 所选择的测定方法应结合实验室条件，使用简便快速、成熟可靠、被公认的测定方法。应用新的测定方法时，应注意所得结果和其他方法所得结果的可比性。（四）研究模式的选择 流行病学研究设计模式一般分为描述流行病学、分析流行病学和实验流行病学研究模式。不论那种研究模式，都可以引入分子生物学理论和技术，构成分子流行病学研究。实验中应根据实际情况选择适当的研究模式。,（五）样本的选择 样本的选择是任何流行病学研究中不可避免的问题，分子流行病学研究样

29、本的选择其原理和方法与一般流行病学研究设计相同，但对分子流行病学来说，样本及其大小的选择难度更大一点。要特别注意样本来源的地区、人群、遗传因素和环境因素的交互作用。（六）质量控制 质量控制是分子流行病学研究设计中一个重要部分，它直接关系到所得结果的准确性、可靠性、科学性和可信性。,1.一般性实验质量控制 确定标本采集方案：包括采集部位、时间及方法；标本采集后的贮存问题等；药品和试剂的选择：同一测定指标最好使用同一批号的药品和试剂。更换批号时应进行对比和标准化；实验方法的确定：对于同一种生物标志的测定要用统一的方法；仪器设备的确定：如无特殊情况，不要更换仪器。调校后一般不应重新调校；操作要规范化

30、：每一实验步骤都要规范化，保证同一操作者或操作者之间的可重复性。,2.设立多种对照 实验开始前就应设立好对照，一般应设以下对照：标准对照（阳性对照）：是指含有待测或某种生物标志，并已知其含量的生物标本；空白对照（阴性对照）：是指不含待测或某种生物标志的生物标本；重复对照（相关对照）：是指来源于同一份待测生物标本具有不同编号的多份生物标本或与待测生物标本有关系的生物标本。,3.预实验 正式实验开始前应进行预实验，确保所用方法的可重复性。一般包括本实验室内和实验室之间不同操作者之间的交叉重复实验等。4.误差、偏倚的控制 分子生物学技术虽然敏感、精确，但导致误差、偏倚的因素也很多。包括:检测者本身、

31、试剂、药品、材料、仪器等；同一受检者的生理生化变化；人群中的生物遗传学差异等方面。应针对具体环节制定详细的质控方法。,（七）分析与总结(Analyses and summary)在研究设计中要预测研究结果，事先确定明确的资料统计分析方法，并拟定资料的总结、分析与报告的详细计划。,Common lab techniques,正确应用实验技术是分子流行病学研究成功的关键。（一）生物标本中核酸的提取(Extraction of nucleic acid from biospecimens)核酸携带有生物体的遗传物质，是生物体细胞的重要组成成分。基因分型、变异分析、多态性分析、基因序列分析等是分子流行

32、病学研究中非常重要的手段之一。但在进行这些分析之前，首先要提取和纯化核酸。,1.DNA的提取(Extraction of DNA)通过破坏细胞质和细胞核膜后，再除去蛋白质可获得基因组DNA。基本过程：（1）在EDTA和变性剂存在下加入蛋白酶K消化除去蛋白质；（2）用 RNA 酶除去 RNA；（3）用酚和氯仿抽提 DNA；（4）用乙醇和异丙醇把 DNA从溶液中离心沉淀出来。,2.RNA的提取(Extraction of RNA)RNA提取的基本过程：裂解细胞；除去蛋白质；提取核酸混合物；将RNA与DNA分离。,（二）质粒DNA的提取(Extraction of plasmid DNA)一般首先培

33、养足够量的细菌，先将所研究的质粒 DNA 转化感受态细菌，然后进行克隆，培养扩增一定量后，提取质粒DNA进行其它分析。提取方法很多，其共同点是：离心沉淀细菌；裂解细菌；除去细菌残壁、染色体DNA、RNA；异丙醇沉淀质粒DNA。实际应用中，有小量提取法和大量提取法之分。,（三）DNA限制性内切酶酶切技术(Restriction endonuclease technique of DNA)限制性内切酶(restriction endonuclease)是一类能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶，是基因工程、基因诊断、DNA序列分析中常用的工具酶。因此，内切酶酶切技术是基因分子

34、生物学中最基本、最重要的技术。限制性内切酶主要来自于原核细胞，每种酶都有自己特定的反应条件如缓冲液、反应温度、作用时间等，根据研究目的可选用小量酶解反应，大量酶解反应和双酶解反应等。然后进行琼脂糖凝胶电泳，对酶切产物（DNA片段）进行鉴定分析。,表1 限制性内切酶酶切反应的一般条件,（四）DNA重组技术(Recombination techniques of DNA DNA重组（DNA recombination)是指将两个基因（或 DNA 片段）经内切酶消化切割，互相交换连接形成新的DNA片段的过程。常将目的基因插入质粒 DNA 载体之中，进行基因重组，基因定点突变分析，结构与功能关系的研究

35、，其功能往往是通过基因表达来测定的。DNA重组的方法主要有粘端连接法、平端连接法和平-粘连接法。具体采用何种方法，要根据目的基因末端的性质、载体 DNA 经内切酶切割后的性质来选择应用。,1.粘端连接法 粘端连接法有两种情况，主要取决于目的DNA粘端的性质。目的DNA两端为相同的粘性末端：带有相同粘性末端的目的DNA可以克隆到具有匹配的相同粘性末端的线性质粒DNA中。优点：目的DNA和质粒DNA连接处的酶切位点仍然保留。缺点：质粒DNA容易自身环化，重组体可能带有目的DNA的串联拷贝，目的DNA可能反方向插入。,目的DNA两端为非互补的粘性末端：用两种不同的内切酶对目的DNA进行消化时即可产生

36、带有互补突出端的DNA 片段。用同样的两种酶将质粒 DNA 切开，这样载体DNA末端和目的DNA末端完全互补，在DNA连接酶的作用下，二者就可形成重组体。此法的优点是：原酶切位点仍然保留；目的DNA只以一个方向插入至质粒DNA中，故此法称为定向克隆；载体DNA末端不互补，不能自身环化。,2.平端连接法 某些内切酶不产生粘性末端，而是产生平端，也称顿性末端。有些情况下，目的 DNA虽经内切酶切割产生粘性末端，但在载体DNA上找不到与之相匹配的酶切位点，这种情况下需将二者或其中之一的粘性末端补平，再采用平端连接法连接。,平接法：目的DNA和载体DNA的平端或粘性末端补齐后用DNA连接酶连接。接头法

37、：此法是利用核酸化学合成技术，合成一种含有特定酶切位点的双链DNA片段（称为接头），再用DNA连接酶将接头连接到目的DNA的两端，然后用该内切酶切割成能与载体DNA粘性末端互补的粘性末端，最后将二者连接。此法适用于没有所需内切酶位点的目的DNA。,3.平-粘连接法 此法在目的DNA和载体DNA只有一个匹配酶切位点，又要考虑目的DNA插入方向时使用，也属于定向克隆。此法优点是单方向插入，非重组体克隆背景低。上述各种方法建立的重组质粒DNA是否成功需要鉴定。常用方法有：互补；插入失活；菌落原位杂交；限制性内切酶分析；DNA序列分析。实验中可根据具体情况来选择鉴定方法。,（五）DNA的凝胶电泳(Ge

38、l electrophoresis of DNA)电泳技术是分子生物学领域中常用的实验技术。常用琼脂糖凝胶电泳和PAGE或SDS-PAGE分离、鉴定、纯化DNA或RNA。此法具有简便、快速、分辨率高等优点，并可将分离片段（电泳带）从凝胶中回收用于 DNA 重组或克隆。,1.琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis)琼脂糖加热至90-100即可熔化成透明液体，浇到电泳槽内，冷却后即可形成凝胶，用于电泳，常用TAE作为电泳缓冲液。电泳时根据DNA片段大小确定凝胶浓度，一般用0.8-1.0%。一般检测鉴定时，用常规琼脂糖凝胶电泳，要想从凝胶中回收DNA，需要低熔点琼脂糖

39、凝胶电泳，若要分析单链DNA，需要碱性琼脂糖凝胶电泳。,图 3 pBSK+-NDV HN DNA琼脂糖凝胶电泳 1：Marker；2,3,5,6,9,10,12：突变株；4,7,8,11：野毒株,2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE PAGE分两种：非变性PAGE：非变性PAGE用于分离纯化双链DNA片段，缺点是不能测定DNA的大小，因为迁移率受碱基组成和序列的影响，同样大小的DNA片段由于空间结构不同，其迁移率出现差异。变性PAGE：变性PAGE用于分离和纯化单链DNA片段，DNA的迁移率与碱基组成和序列有关，可用于DNA序列

40、分析，分离同位素标记的探针等。,1 2 3 4 5图 4 风疹病毒E1基因表达产物SDS-PAGE（上清，考马斯亮蓝染色）1:Negative control GS1152:Plasmid control pGAPZA3:Low range protein marker4:Expression strain 15:Expression strain 2,3.从凝胶中回收和纯化DNA(Recovery from gel and purificaiton of DNA)在进行基因克隆、重组、探针标记等实验中，需要从凝胶中回收DNA，回收的方法有：低熔点琼脂糖法 压碎浸泡法 透析袋洗脱法 DEAE-

41、纤维素膜法等。上述每种方法均有各自的使用范围、回收率和特点，应根据情况选择合适的回收方法。,（六）核酸杂交(Nucleic acid hybridization)据DNA碱基互补配对原理，先制备一条带有标记的多核苷酸链作为探针,检测标本中与之相对应的那条互补链，称为核酸杂交(nucleic acid hybridization)。核酸杂交技术具有高度特异性，广泛用于对待测DNA或RNA进行定性和半定量分析。,核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、cRNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等。实验时根据研究目的选择不同类型的探针。探针需用标记物标记。标记物一般分为放射性标记和非放射性标记。两种标

42、记方法各有优缺点，放射性标记灵敏度和特异性高，但应用不当时放射性物质易造成环境污染和人体损害，同时也比较昂贵。所以，近年来非放射性标记方法越来越多，并不断完善。放射性标记物有3H，14C，32P，35S，125I，131I等。非放射性标记物有生物素(biotin)、地高辛(digoxigenin，Dig)、荧光素(fluorescin)、标记金属等。,核酸杂交方法很多，如：斑点杂交(dot hybridization)原位杂交(In-situ hybridization)Southern杂交(Southern hybridization)Northern杂交(Northern hybridiz

43、ation)等。,（七）聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR PCR 技术在分子流行病学研究中具有非常重要的地位。已被广泛地应用于体外基因扩增、基因诊断、基因克隆、基因序列分析、基因定点突变分析等。优点是简便、快速、灵敏等。缺点是实验室污染问题，易出现假阳性。,基本原理是：根据待测基因两端设计一对引物，即上游引物和下游引物，在标本中模板存在的情况下，耐热DNA聚合酶可利用四种dNTP使引物沿着模板延伸。整个过程可分为三个步骤：变性94-97 30-50S；退火25-65 60-90S；延伸70-74 60-120S。一般重复25-30个循环，即可进行琼脂糖凝

44、胶电泳。用杂交、PCR-SSCP、序列分析等对扩增产物进行分析。PCR技术不断发展和完善，并产生了一些改良的PCR方法，如定量PCR、原位PCR、RT-PCR、免疫PCR等等。,（八）DNA序列分析(DNA sequencing)DNA序列分析是鉴定基因一级结构、基因突变分析、突变株检测等研究的重要手段。测序方法很多，常用的是双脱氧末端终止法。基本原理：特异性引物和DNA模板相退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，在双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作用下进行特异性链的终止，然后用PAGE区分长度相差一个核苷酸（nt）的DNA，通过一定的显示阅读nt序列。目前测序工作已与计算机相结合，趋向于自动

45、化，因此大量测序仪应运而生，并得到广泛应用。,固定末端ACGTTGCACGTA“A”反应“C”反应“G”反应“T”反应 A AC ACG ACGTACGTTGCA ACGTTGC ACGTTG ACGTTACGTTGCACGTA ACGTTGCAC ACGTTGCACG ACGTTGCACGT,PAGE：A C G T ACGTTGCACGTA ACGTTGCACGT ACGTTGCACG ACGTTGCAC ACGTTGCA ACGTTGC ACGTTG ACGTT ACGT ACG AC ADNA序列测定基本原理示意图,（九）蛋白质的SDS-PAGE及肽图分析(SDS-PAGE of pr

46、oteins and peptide analysis)1.SDS-PAGE 不同的蛋白质由于肽链中氨基酸组成不同，其所带电荷的性质和数量有差异，构象也不同。因此，当分子量相同的两种蛋白质进行PAGE时，它们的迁移率可能有很大差异。当在样品中加入 SDS 和2-ME时，2-ME能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质分子的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量的负电荷，它的量远远超过蛋白质自身的电荷量，使蛋白质-SDS复合物带有相同密度的负电荷。因此，消除了不同蛋白质间原有电荷的影响。,SDS与蛋白质结合还能使蛋白质构象发生改变，不同蛋白质-

47、SDS复合物的短轴长度都一样，为18A，而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样电泳时不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，迁移率只与蛋白质分子量有关，就能测定样品中的各蛋白数目和分子量（MW）。蛋白质MW与相对迁移率呈反比。相对迁移率=样品迁移距离（cm）/溴酚蓝迁移距离（cm）。根据标准蛋白制备标准曲线：一般用5种已知分子量的蛋白。估计待测样品蛋白分子量在这5种标准蛋白范围之内，使结果会更准确。,MW 测定蛋白质分子量标准曲线简图,2.肽图分析 SDS-PAGE所得到的电泳条带可以进一步分析其氨基酸构成。基本原理：将SDS-PAGE的蛋白带切下，用125I标记。用胰蛋白酶消化125I然后进行电

48、泳和层析，经放射自显影后，可得到特征性的图谱，称为肽图(peptide mapping)。肽图的差异反映底物蛋白质的氨基酸残基顺序的不同，当然这种差异最终是由基因结构的不同所决定的。肽图分析可用于分析蛋白质的一级结构、抗原变异、基因结构比较、病毒分型等。,（十）细胞转化与转染技术 Cell transformation and transfection techniques 我们习惯将质粒DNA导入细菌细胞内，称为转化(transformation)。将质粒DNA导入真核细胞内称为转染（transfection)。1.转化 当获得新的质粒DNA或重组体时需要转化到宿主菌体内，进一步扩增，以便获

49、取大量DNA进行进一步研究。转化的方法有多种，常用CaCl2法。CaCl2处理细菌后，细胞壁细胞膜结构发生改变，使质粒DNA从细胞外导入细胞内。将转化反应物（内含已转化的和未转化的细菌）涂到选择性培养皿上，转化成功的细菌能在抗性培养基上生长形成菌落。,2.转染 转染技术已广泛用于生物学、医学等各个领域，主要用于基因结构与构成的研究，基因表达与调控的研究，基因治疗与转基因动植物的研究等等。细胞转染的方法有多种，如脂质体介导转染法、电击法、DEAE葡聚糖介导法、磷酸钙介导法等。其中脂质体法较常用，脂质体介导转染法转染效率是磷酸钙法的几十倍，甚至上百倍，并具有广谱、操作使用简便的优势。脂质体试剂Li

50、pofectin或Lopofectamine能与靶DNA的磷酸骨架结合而生成的复合物能轻易通过细胞膜进入细胞内，完成转染过程。,（十一）基因定点突变分析(Site-directed mutagenesis)1.模板(template)：含有待突变的DNA重组载体，通常为单链；2.引物(primer)：含突变位点；3.突变反应(mutagenesis)：新合成的一股，含突变位点；4.克隆突变株(cloning of mutant)：转化大肠杆菌，挑选突变株；5.纯化DNA(purification of DNA)：微量法；6.转染与表达(transfection and expression)：