第五章基因克隆载体.ppt

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1、基因克隆载体,第一节基因克隆载体的特点与分类,1 基因克隆载体的含义及特点含义：能够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗传的DNA或RNA分子,基因克隆载体的特点,特点:1）具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点 2）进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与染色体整合在一起 3）在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的受体细胞染色体DNA一起复制 4）外源基因能在受体细胞中表达 5）克隆载体进入细胞后有可供选择标记,克隆载体的分类,a)质粒载体：大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体，酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体b)噬菌体载体：双链DNA噬菌体载体；单链DNA噬菌体载体，M13

2、，T3，T7c)病毒载体：植物病毒载体CaMV（花椰菜花斑病病毒）；动物病毒载体 SV40（猿猴空泡病毒）d)质粒和噬菌体DNA兼有的载体：Phasmid 载体（含有f1 噬菌体的ori）；Cosmid 载体（含有DNA的Cos区）e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector）基因整合平台系统；克隆载体,2.1 按构建克隆载体DNA的来源分类,2.2 按克隆载体的用途分类,a)cDNA克隆载体：gt11，pT7T3，b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载 体：pGEX-2T，pGEX

3、-3X d)真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV e)转录（Transcription）载体：pSL1190 f)普通载体（General vector）：pBR322，pUC18,第二节 质粒克隆载体,质粒(plasmid)是一种存在于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA分子,质粒载体的一般特性,1）质粒的组成与构型,细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子细胞外：超螺旋、开环，线形,质粒DNA分子的大小:细菌质粒的大小相差较大，小的仅不足1kb，大的可达数百kb.不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同的质粒不能存在于同一细胞中可转移性：质粒可通过接合作用等

4、方式转移到新的宿主细胞中 复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列,质粒载体的特性,质粒上的相关基因,A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积累到足以阻止质粒的复制B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同一宿主细胞中D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗

5、传物质的转移E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，TcrF）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等H)致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒,几种常见的质粒载体,）pBR322：,pBR3224363,优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，部分缺失的La

6、c操纵子片段，并在Lac Z区组装了MCS,pUC 18-19多克隆位点,3）pBluescript M13：含有M13噬菌体DNA复制起点的载 体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动 子的一个来自pUC质粒的载体当中,4）Ti质粒载体,人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年Smith和Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。,农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化,1、T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时，从Ti质 粒上切割下来转移到植物细胞上的一段DNA2、Vir区：毒区，激活T-DNA转

7、移。与T-DNA区相邻，二者共占Ti质粒DNA的1/3。3、Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接 合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在 农杆菌之间的转移。4、Ori区：复制起始区,病毒区基因及功能,Ti质粒T-DNA的边界序列,质粒载体的构建,1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行松弛型复制.*选择松弛型质粒复制起始子(Ori)2)构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS)3)构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr)4)构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片段较大.,3.1 质粒构建的基本要求,3.2 pBR322质粒载体的构建,.3 pU

8、C18-19 质粒载体的构建,以pBR322为出发质粒，用含乳糖操纵子O、P和Z的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z区组入一个多克隆位点,pUC18-19的构建,筛选重组子的示意图,利用菌落颜色筛选重组子,3.蓝藻质粒载体的构建,蓝藻作为受体细胞的特点 a）原核生物，能进行光合作用，具有固氮能力 b）基因组简单，50%的蓝藻含有质粒 c）细胞大（10-10于E.coli）储藏蛋白多，单一蛋白可达 25%，而大肠杆菌仅为5%d）蛋白更新慢，容受性比较大 e）蛋白酶的降解作用比较低，产物比较均一 蓝藻质粒的特点 a）双向载体（需要两种Ori）b）合适的选择标记 c）分子大小合适 d）

9、拷贝高,蓝藻质粒载体pAQE17的构建,3.农杆菌Ti质粒载体的构建,设计原理:保留T-DNA两侧的边界序列,插入选择 性标记,除去致瘤基因和无关基因.共整合质粒载体:将T-DNA区段编码致瘤基因和 冠瘿碱合成酶的基因由pBR322上的一段DNA片段取代,当携带目的基因片段的pBR322衍生中间载体进入农杆菌细胞后,两者相同的pBR322序列之间发生同源交换,导致外源目的基因片段整合到Ti质粒上.,外源片段共整合到Ti质粒上的过程,双向载体：由两个以上的质粒构建而成.将Ti质粒的Vir与广宿主范围质粒的携带目的基因(MCS)、选择性标记、转移和复制功能整合在一起.双向载体可在大肠杆菌和农杆菌中

10、进行复制并稳定存在下去,双向Ti质粒载体的构建,第三节 噬菌体衍生的克隆载体,.1噬菌体的一般特性 噬菌体的组成 结构：外壳蛋白 DNA 形态：头部 尾部,噬菌体克隆载体,a)在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)在两端各有12个碱基组成的5单链互补粘 性末端(Cohesive end),进入宿主细胞后,粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)5-GGGCGGCGACCTXXXXG-3 XXXXCCCCGCCGCTGGA-5 b)基因组DNA上有多种限制酶识别位点 c)噬菌体包装DNA的大小为原DNA长度的 75-105%(38-54 kb),基因组DNA的特点,1.2 基因组DNA的

11、结构,噬菌体的组装,1.3 噬菌体载体构建的策略,a)去除部分限制酶识别位点b)去除非必需区DNA J-N；P-Qc)插入可供选择的标记基因,常用的噬菌体衍生载体,载体名称 分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon 3A 4.83 0 21.4 Charon 4A 4.54 0 20.1 Charon 17 4.64 0-22.4 Charon 20 40.36 0 21.37 Charon 21 A 41.7 0 21.08 Charon 28 39.39 0 20.05 Charon 30 46.76 0-20.24 LA 7 1 40.6 0 24.1 Sep6-la

12、c 5 44.3 0 22.4 BF 101 46.0 6.3 24.4,2.Cosmid克隆载体,2.1 Cosmid载体的特点 a)兼有噬菌体和质粒载体的特点含有噬菌体Cos位点(可进行体外包装)和细菌质粒载体的复制子(选择标记,可在细菌中保存和大量复制)b)可插入大片段外源DNA,2.2 部分Cosmid载体,Cosmid载体 复制子 分子量(kb)选择标记 克隆位点 克隆能力(kb)C2XB pMB1 6.8 Apr,Kmr Bam HI,Cla I,EcoRI 32-45 Hind III,Pst I,Sma I pHC79 pMB1 6.4 Apr,Tcr EcoR I,Hind

13、III,Sal I 29-46 BamHI,Pst I,Cal IpHS262 Col E1 2.8 Kmr Bam HI,EcoR I,HincII 34 46pJC74 Col E1 15.8 Apr EcoR I,BamHI,Sal I 21 37pJB8 Col E1 5.4 Apr BamHI,Hind III,Sal I 31 47MUA-3 pMB I 4.8 Tcr Pst I,EcoR I,Bal I 32-48pTL 5 pMB I 5.6 Tcr Bgal I,Bal I,Hpa I 31 47pMF7 pMB I 5.4 Apr EcoR I,Sal I 32 48,3

14、.M13衍生的克隆载体,3.1 M13噬菌体的特点,3.2 M13 DNA的复制与M13噬菌体的增殖,a)M13噬菌体吸附在大肠杆菌表面F性毛上,M13 ss-DNA(+链)进入细胞 b)在宿主细胞内以+链为模板合成大量的-DNA 链,成为双链复制型DNA(RF-DNA),同时在宿 主细胞内合成大量的特异性蛋白与+链DNA 结合 c)RF-DNA 以-DNA为模板不断合成+链DNA,与特异性蛋白结合,组装成新的噬菌体颗粒.释放到细胞外,而不破坏宿主细胞,3.3 M13 衍生的克隆载体,第四节 植物病毒载体,1.花椰菜花斑病病毒（Cauliflower Mosaic Virus,CaMV)环状双

15、链DNA病毒，由蚜虫以非持久方式或半持久方式传播、感染十字花科和少数非十字花科植物,1）CaMV-DNA的一般特性,环状双链DNA（8031bp），在病毒颗粒中 以开环的形式存在，分别在-链上有一个缺口(1），+链上有两个缺口（2，3），在缺口中形成三链结构,花椰菜花斑病病毒DNA缺口的结构,缺口1：GAATTT TTT AA 5 3 GC ATTT TTT AA 5 5 CGCT TAAAAAATT 3缺口2：5 GGTTGATTACTCGAGCC 5 GGTTGATTACTCGAG AA 3 3 CCAACTAATGAGCTCGGTT 5缺口3：5 TCCAATAGTCT TC TTTTT

16、CAG 5 TCCAATAGTCT TC TTTTT G AA 3 3 AGGTTATCAGAAGAAAAACTCTT 5,CaMV DNA分子上有八个开放阅读框（ORF)和三个间隔区 ORF I：编码运动蛋白，负责CaMV在细胞间运转 ORF II：表达产物与蚜虫口针或前肠的特殊位点 相结合，参与蚜虫的感染 ORF III：编码病毒结构蛋白 ORF IV：编码外壳蛋白 ORF V：编码逆转录酶 ORF VI：宿主范围，病害的发生和症状的出现等密切相关。ORF III：功能不清楚 ORF IV：功能不清楚,2)CaMV基因区,病毒增殖,缺口闭合,侵染,编码病毒反转录酶，35S反转录,表现症状和

17、宿主范围,编码外壳蛋白,花椰菜花斑病病毒基因组DNA的结构,3)CaMV DNA的间隔区,IR 1：位于ORF VI和ORF VII之间，长度为 700 bp，含有启动转录35S RNA的启动子 IR 2：位于ORF VII和ORF I之间，长度为60bp IR 3：位于ORF V和ORF VI之间，长度为60bp，含有启动19S RNA转录的启动子,CaMV 35S启动子序列,4）CaMV-DNA限制性内切酶识别位点,在CaMV-DNA的非必需区（II区和VII区）含有限制酶识别位点（如BstE II和Xho I），这些单酶切位点可用于插入外源DNA片段,CaMV（Cabb B-S）DNA的

18、部分酶切位点,5）CaMV-DNA的存在状态与感染能力,DNA 状态 伤口感染 CaMV+CaMV-DNA+CaMV-DNA-单酶切+CaMV-DNA-双酶切 5%CaMV-DNA-双酶切-插入DNA-CaMV-DNA+克隆载体-,6）CaMV的转录复制与CaMV的增殖,7)CaMV-DNA克隆载体的构建,基本策略和要求*利用病毒对宿主细胞感染的特性*利用DNA分子上的单酶切位点*替换非必需区*高拷贝地存在于植物细胞中,互补载体系统,由缺陷型CaMV-DNA分子(携带外源目的基因)+辅助CaMV-DNA分子(携带缺陷型感染所需的基因)共同感染 进入植物细胞并表达缺点:突变体之间发生重组,重新产

19、生野生型CaMV,混合载体系统,将CaMV-DNA整合到Ti质粒DNA分子上,使新的载体同时具有CaMV和Ti载体的特性.通过根癌农杆菌转移到植物细胞中.特点:*扩大了CaMV的正常宿主范围*避免了CaMV突变体之间的基因重组,2.烟草花叶病毒（TMV)克隆载体,烟草花叶病毒为短杆状，基因组为单链RNA，长为6395个碱基，包括四个阅读框 ORF 1：编码126kD蛋白质，参与病毒复制 ORF 2：编码183kD蛋白质，参与病毒复制 ORF 3：编码移动蛋白（MP)，分子量（30kD）ORF 4：编码病毒外壳蛋白（CP,17.5kD）,TMV 的 结 构 特 征,TMV克隆载体构建的策略,47

20、5/476,Q/G,Q/G,E/G,692/693,868/869,(67K),ALSV-RNA1(6813nt),Vpg(?),(A)n,ALSV-RNA2(3385nt),(65K),(80K),25K,Vp25,Vp20,Vp24,PRO-co,HEL,C-PRO,RdRp,Vpg(?),(A)n,243K,119K/108K,53/42KP,ALSV-RNA1和RNA2的基因组结构,Apple spherical latent virus(ALSV),ALSV-RNA2(3385nt),(1731),Q/G,Q/G,E/G,53/42KP,Vp25,Vp20,Vp24,1402,S L

21、 H R S D P N L L E G Q,/,G P D F T K I I W P T V V E R N F S NP,1500,Q/G,Q/G,XhoI,BamHI,pER2L10R19GFP,GPDFTKIIWRTVVERNFSN,LE,GFP,GS,RSDPNLLEGQ,Vp25,42K,Q,G,pER2L10R15GFP,GPDFTKIIWRTVVER,GFP,GS,RSDPNLLEGQ,LE,Vp25,42K,Q,G,LE,pER2L5R15GFP,GPDFTKIIWRTVVER,GFP,LLEGQ,GS,Vp25,42K,Q,G,LE,pER2L5R10GFP,GFP,LL

22、EGQ,GPDFTKIIWR,GS,Vp25,42K,Q,G,pER2L5R5GFP,GPDFT,GFP,LLEGQ,42K,Vp25,LE,GS,Q,G,pER2L4R5GFP,GPDFT,GFP,LEGQ,42K,Vp25,LE,GS,Q,G,pER2L4R3GFP,GPD,GFP,LEGQ,42K,Vp25,LE,GS,Q,G,侵染性,+,+,+,+,+,-,-,插入GFP的病毒表达载体中的蛋白酶位点附近的氨基酸序列及表达载体的侵染性斜体文字是限制性内切酶由来的氨基酸。,GFP,接種葉,接種葉,上葉,上葉,表达GFP的ALSV载体(pER2L10R19GFP+pEALSR1)侵染的Che

23、nopodium quinoa(第二代)的接种叶和上叶的GFP荧光,第五节 动物病毒基因克隆载体,1.猿猴空泡病毒40（Simian virus 40，SV40),1)SV40 DNA的一般特性 SV40 DNA为环状双链DNA（5243bp），与宿主细胞组蛋白H4，H2A，H2B和H3结合，组成念珠状核小体-微型染色体（mini-chromosome）SV40 DNA编码两个基因区，早期转录区和晚期转录区，分别以相反的方向转录,SV40基因转录图,SV40 DNA单识别位点限制性内切酶位点,限制性内切酶 识别位点 Kpn I 294 Nae I 343 Hpa II 346 Hae II 8

24、32 EcoR I 1782 BamH I 2533 BstX I 2759 Taq I 4739 Bgl I 5235,2）SV40-DNA的转录、复制与增殖,SV40 感染并进入细胞 病毒DNA进入细胞核 进行早期转录，合成T抗原 启动病毒DNA复制 晚期转录，合成包装蛋白 组装成病毒颗粒，细胞裂解,3）SV40 DNA衍生的克隆载体的构建,构建SV40 DNA衍生克隆载体的策略 a)保留完整的T-抗原基因.b)保留复制起始点(Ori),间隔区和终止序列 c)替换晚期转录区基因或部分早期转录区.,SV 40 DNA晚期转录区取代型载体,重组病毒质粒载体,含有完整早期区段和复制起始点的病毒质

25、粒载体,2.腺病毒克隆载体,腺病毒（adenovirus,Ad）是一类无囊膜的20面体病毒，含有一个线性双链DNA分子。Ad-DNA两端具有逆向末端重复序列IRT在每一条单链DNA的5端共价结合一种特殊结合蛋白（5.5 kD）TP，当DNA从病毒颗粒中释放后，通过该蛋白连接成环状,腺病毒结构,腺病毒DNA的结构,腺病毒克隆载体的构建,第五节 反转录病毒衍生的克隆载体,反转录病毒（retrovirus)是一类含RNA的病毒感染到动物细胞后，病毒RNA通过反转录产生双链DNA分子，可整合到宿主细胞染色体上或成为原病毒，随染色体DNA进行复制、转录和翻译,1.劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma

26、Virus，RSV),1）RSV基因组的特点 基因组由四条RNA分子构成，两条38S RNA编码病毒的全部遗传信息，两条较小的RNA分子为宿主细胞的tRNATrp 38 S RNA链带有两段相同的r序列的非编码区，分别位于5-末端和3-末端.,RSV病毒RNA分子结构,2）RSV病毒的复制与原病毒DNA的转录翻译,3)反转录病毒克隆载体构建策略,a）从感病细胞中分离原病毒DNA.b）根据不同需要引入选择标记、外源基因及 DNA 复制的启动子.c）与质粒载体重组构建反转录病毒克隆载体 d）转化受体细胞E.Coli e）包装成新的反转录病毒颗粒.f）感染目的宿主细胞（动物细胞），外源基 因导入动物

27、细胞.,第六节 基因定位整合克隆载体,为了保证外源DNA在细胞中稳定遗传并不对宿主细胞的代谢产生较大的影响，建立基因整合平台系统，使外源基因定位整合到染色体特定的位点它包括整合平台和整合克隆载体两部分 整合平台：受体细胞基因组上给定的DNA区域 整合克隆载体：含有一个或两个与整合平台区核苷酸序列同源的DNA片断,外源DNA整合到染色体上,1.定位整合克隆载体的种类,1)内源平台双交换置换克隆载体,2)外源平台双交换置换克隆载体,3)内源平台双交换插入克隆载体,4)内源平台单交换插入克隆载体,2.整合克隆载体的整合效率,基因定位整合的效率与受体细胞的种属和同源DNA片断的长短有关 鼠胚胎干细胞h

28、prt基因整合平台系统定位整合效率,3.定位整合克隆载体的应用,细菌染色体基因定位整合载体蓝藻染色体基因定位整合载体酵母染色体基因定位整合载体植物染色体基因定位整合载体动物染色体基因定位整合载体,第七节 人造染色体载体,1.细菌人造染色体(BAC)载体,2.酵母人造染色体（YAC）载体,人造酵母染色体（Yeast Artificial Chromosome）a）保持染色体稳定所必需的顺式作用因子被 确定 b）建立了酵母高效表达系统 c）建立了大片段DNA分离的方法（脉冲场凝胶电泳）目的：用于克隆大于100 kb的基因组DNA某些 基因如人凝血因子VII基因长达180kb，肌 营养不良基因大于1

29、800 kb,1)pYAC4人造染色体,2)YAC克隆载体的应用,构建基因组文库或克隆外源基因:利用YAC构建基因组文库或克隆外源基因的过程类似于原核生物基因组文库的构建和DNA的克隆过程，通过酶切、酶连和转化等一系列过程在含有单臂或双臂所需成分的琼脂糖平板上鉴定保持人工染色体的酵母染色体当DNA插入到克隆位点后，打断了抑制型tRNA基因，致使带ade 琥珀突变基因的酵母株形成红色而不是白色的菌落,YAC克隆基因中的注意事项,基因组在剪切力相对较小的环境中制备，以得到平均数千kb的DNA片段 以稀切限制酶不完全切割DNA片段，产生200-500 kb的DNA片段（稀切酶可以减少文库中的重叠克隆

30、子）以酵母球形体转化重组YAC克隆载体，提高转化效率（500个转化体/g DNA）,第八节 基因表达载体,1 原核生物基因表达载体 1)特点：a）含有强的启动子（如trp启动子）b）含有lac Z核糖体的结合位点 c）含起始密码的基因插入到MCS均能表达 d）含有强的终止子（核糖体RNA终止子rrnB）e）表达产物为单一蛋白,三种表达型载体结构图,原核生物基因表达载体 pKK223-3,2）原核生物基因融合表达载体,一般特性：a）含有高水平表达的启动子 b）基因的表达可被诱导（化学物、温度等）c）在原核宿主中表达，产物为融合蛋白 d）表达产物易于分离纯化,GST基因融合表达载体（pGEX-5X

31、-3）,谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）,蛋白A基因融合表达载体(pEZZ18),特点:a)含有蛋白A信息序列和两个合成Z区 b)表达产物为分泌蛋白，Z区可与IgG Sepharose 6FF结合，易于纯化表达产物,pEZZ18载体,pMC1871融合表达载体,特点：含有-半乳糖苷酶，外源基因插入E.coli lac Z基因中，表达杂合蛋白，而杂合蛋白的-半乳糖苷酶活性可作为检测标记,pMC1871载体,2.哺乳动物基因表达载体（pKSV-10）,特点：a）穿梭质粒载体（可在E.coli 中复制保存）b）含有质粒复制的起始位点和抗性标记（Apr）

32、,3.植物基因表达载体（pCaMVCN）,特点：a）含有CaMV35S启动子和Tn9的Cat基因 b）在单子叶植物和双子叶植物中均有活性,杆状病毒表达系统(baculovirus expression system)目前被广泛应用的是苜蓿银纹夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV),属一种溶原性病毒。基因组为双链DNA，可感染节肢动物。国内应用的是家蚕核多角病毒。,特殊用途克隆载体,启动子探针型克隆载体诱导型表达克隆载体反义表达克隆载体组织特异性表达克隆载体含增强子表达载体。,作业题：1.根据已有的质粒载体构建基因克隆载体，要求新构建的克隆载体能在含氨苄青霉素（Apr）和卡那霉素(Kar)的培养基中生长，有可插入外源DNA片段的多克隆位点(MCS)，且分子量小于2.5 kb(E:EcoR I；B：BamH I；K：Kpn I)。,2.如何将野生型细菌质粒改造为基因克隆载体？3.YAC载体具有那些特性？,