蛋白质化学第九章 连续自由流电泳.ppt

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1、连续自由流电泳,概述连续自由流电泳理论仪器系统分离模式应用结语,概述,提起连续流电泳我们可以回顾到1950年瑞典Sevensson和德国Grassmann，Hannig创建了纸上连续流电泳，70年代涌现出连续自由流电泳，连续流电泳我们可以回顾到1950年瑞典Sevensson和德国Grassmann，Hannig创建了纸上连续流电泳，70年代涌现出连续自由流电泳，Hannig有很权威的评述。,众所周知，电泳在分离纯化生物活性物质上有许多重要的优点，其中包括良好的分辨率，可控的分离过程，温和的分离条件，无需相的改变（如沉淀和吸附）等，而且这些优点在大规模制备时将更加显示其重要性。放大制备性电泳几

2、十年来一直是生物学家和生物技术学家们研究的一个主要目标。而自由流动体系（假设没有抗对流的凝胶或类似支持介质的体系）则提供了唯一真正的实用性手段来达到这样一个目标。,自由流电泳广义地可以理解为在无固相支持介质,用特定缓冲液作为分离介质的分离系统中所进行的可溶性分子或不溶性颗粒的电泳分离纯化技术,它可采用多种类型的仪器系统。狭义地说,自由流电泳则可以被认为是在无支持介质的薄的矩形分离腔中,用缓冲液来作为分离介质的比较温和的电泳分离过程,后者也被称为Hannig型自由流电泳，目前其应用范围最广。,对比其他分离纯化技术而言，自由流电泳的主要优点在于它是一个连续而不是分批进行的分离过程。它可以用于连续的

3、分离，直到样品被处理完全，而不像液相色谱和凝胶电泳那样在纯化大量物质时需要重复上样。所以，使用自由流电泳可以节省大量的时间和人力。而且，由于自由流电泳分离一般不使用有机溶剂，高盐溶液及硅胶或凝胶等介质，其异常温和的分离条件十分适合蛋白和细胞等生物物质的分离纯化。,尽管热对流，分子沉降和电动流体力学变形等一些问题会引起样品流的扰动而降低自由流电泳的分辨率，使得其应用受到一定的限制：但由于它在分离生物大分子方面显示出许多独特的优点，所以把自由流电泳发展成为一种制备型生物技术使其进一步完善仍在继续。,一 连续自由流电泳理论,1.分离原理 连续自由流电泳(continuous free-flow el

4、ectrophoresis，CFE)样品的分离是处于流动状态下的缓冲液中进行的样品连续地加人到流动的缓冲液中，由缓冲液携带样品从电泳分离室的底部流动到顶部样品在流动过程中受到横向电场的作用这样，由于样品中不同带电粒子的横向移动速度不同，样品被分为几束，从而将其分开，在出口处收集连续自由流电泳的分辨率主要由分离样品的最高峰间距和条带的扩散程度来决定。,电泳在无胶的一种薄层液相基质中进行。样品通过专用的蠕动泵注入分离腔，分离腔由两个平行的特制平板构成，腔体高0.5 mm。层流驱动样品在分离腔中运动，带电粒子（蛋白质、细胞器、膜类、或完整的细胞等）在分离缓冲液中，由垂直于液体流方向的高电压驱动，流动

5、方向发生偏斜而被分离。根据等电点、分子量大小、分子形状等泳动能力不同，样品被分离成96个组分，收集到96孔收集器中。,2.影响因素 自由流电泳分离过程是一个极为复杂的动态过程，其中所涉及的相关因素不但种类较多而且常常相互关联，如热对流，流体力学变形，电动力学变形，电动流体力学变性等。若把所有的影响因素都考虑在内，那么列出的方程组用现有的数学方法将无法解出。通过建立相应的数学模型，并进行自由流电泳的计算机模拟，我们下面就分类讨论自由流电泳中的一些影响因素：,热力学不稳定 所以自由流电泳分离中常常选用低电导分离缓冲液，并使用比较薄的分离腔以及对整个分离墙进行有效的冷却或对分离缓冲液进行预冷是最常见

6、的方法。流体力学变形 是另一个自由流电泳固有的现象。为了解决这个问题，首先可以减小样品输入口的口径，但会使电泳的物料流通量减小。另一个办法就是增加分离腔的厚度，但这同时会带来由于散热效果差而造成的热对流问题。,电动力学变形 可以通过调节上下两个区域的电场强度来解决。电动流体力学变形 它在自由流电泳分离过程中占有很重要的地位，而且与重力的影响无关，也就是说，即使在微重力环境下这种变形效应仍可能存在。结局儒这个问题的方法通常是仔细的调整样品流与分离介质的电导，使得它们大致相等，但这在蛋白质样品浓度较高时很难做到。,电动学效应 一般讨论时都假设蛋白质的电泳迁移是不受周围环境影响的，但实际上在电解质溶

7、液中加上直流电场后，溶液中的所有离子都将发生电迁移。但溶液中不同离子的迁移必须同时满足其周围的电中性和化学平衡的条件。这就意味着蛋白质样品流附近的离子浓度常常会发生不定的变化，从而产生所谓的电动化学效应。,驰豫效应 在低浓度电解质溶液中主要根据物质的大小应用电场来进行分离。浮力驱动的干扰效应 分离缓冲液与样品流之间以及分离缓冲液自身之中的密度差异可以引起自然对流现象。在自由流电泳中，样品通过溶解在与分离缓冲液类型相同但浓度则未必一样的溶液中。这样，由于蛋白质的存在以及离子浓度的不同，分离缓冲液与输入的样品流之间爱女会存在密度差异。,膜的影响 解决办法有三种：（1）使用薄膜和大的电极液-分离液浓

8、度差。（2）使用具相反极性的膜，并使用可在分离区域内产生两个积聚区的电流方向。（3）使用具有高浓度边界溶液。,另外，非常重要的是，在地基自由流电泳实验中，重力加速度是一个不可忽视的影响因素。它与许多影响因素有关，如热对流，流体力学变形，分子沉降等。这些效应在进行自由流电泳的放大实验时显得尤为严重。因此，要进一步提高自由流电泳的分辨率和产率，必须在微重力条件下进行电泳操作。不少国家已经开展了空间自由流电泳的研究工作并取得了长足的进展。,二 仪器系统,自从Tiselius的U形管电泳装置问世以来，电泳仪的研究已经走过了很长一段历程。可以克服对流及样品流变形等问题的一些方法已经得到了发展，许多不同类

9、型的仪器也已商品化。人们朝着使蛋白产率最大化，蛋白分离最佳化，自由对流不稳定性最小化以及蛋白区带扩散最小化等目标对自由流电泳分离装置的设计进行了研究和探索。初步回答了对于一个给定的仪器和已知的蛋白质，应使用什么样的流速和电场强度的问题。,1.仪器组成 一台典型的连续自由流电泳仪包括四个组成部分：泵送分离缓冲液，样品及电极循环缓冲液的泵；电源；级分收集器；分离单元。,泵送分离缓冲液的泵通常是多管道蠕动泵，它既可以放在分离缓冲液入口的前面，也可以放在出口的后面。样品及电极循环缓冲液泵也通常是蠕动泵；分离缓冲液泵和电极循环缓冲液泵有时还可用同一个泵。分离单元包括分离缓冲液和样品的输入口，分离腔和电极

10、。,分离腔通常是由一定厚度的间隔物隔开的两块由玻璃，聚碳酸酯，Plexiglas有机玻璃（Rohm&Hass公司），Lucite有机玻璃（E.I.DuPont DeNemours公司）等材料制成的矩形板构成。分离缓冲液和已分开的样品离开分离腔后进入有许多出口管组成的级分收集器中。电源要求其所能提供的最大直流电压应达到300V/cm以上，最大电流达到200mA以上。,2.电泳操作 连续自由流电泳的基本操作包括安装和清洗分离腔，缓冲液和样品的加注，电泳，收集和检测等步骤。（1）安装和清洗分离腔 久未使用的分离腔的前后壁应以酒精或异丙醇湿润的棉花球仔细擦洗。（2）条纹试验 即用色素或染料检查分离腔的

11、层流稳定性。,（3）缓冲液的加注 开启冷却至所需温度，然后加注分离缓冲液。（4）加电压 在加电压之前，还需要对收集管进行仔细的抽气，保证每管畅通并流速均匀。（5）加注样品和电泳分离 选择合适的缓冲液流速和上样速率是连续自由流电泳分离的关键之一，电泳时间通常为1h左右，电泳过程中如出现气泡，应停止电泳。,（6）收集样品和检测 电泳结束后，取出收集管，并对美观进行光吸收值的检测。电泳结束后的分离腔应以超纯水清洗，如长期不用，可用含0.01%的叠氮化钠进行防腐处理，并取出电极膜，间隔条等作适当保存。,三 分离模式,CFE有四种最基本的分离模式，即区带电泳（zone electrophoresis,Z

12、E）,等速电泳(isotach-ophoresis,ITP)，等电聚焦(isoelectric foc-using,IFE)及电场梯度电泳(field step electorphoresis,FSE)，这四种模式各有千秋，下面就分别对这些分离模式作简单介绍。,1.区带电泳(ZE)区带电泳是连续自由流电泳最常用也是最简单方便的一种分离模式。其中所用的分离缓冲液pH和电导都是均一的。分离是基于溶质离子的电荷质量比，要选择维持稳定pH和电导的缓冲液，因为蛋白质分子受pH的影响很大。pH的选择是根据蛋白质的等电点，pH选在样品等电点相主要杂质pH之间。,此外样品的稳定性和pH很有关系。电压和流速是相

13、当重要的，增加电压和降低流速会增加混合物之间的分离距离；增加电压，焦耳热也增加，影响到电渗变化。降低流速会增加热对流的变化，也降低了分离的量。因此在通过量和分辨力之间的折衷，需要调节电压和流速。在ZE中，均一的分离缓冲液从一个输入口连续泵入分离腔并在腔内形成薄层液流，待分离样品则在稍稍下游处进入分离腔,ZE最具吸引力的优点是其分辨率很高，回收率也搞，而且进样能力仅仅受到分离腔容积的限制。另外，ZE设置较简单，易于操作。ZE的缺点是产率不高，而且有条带扩散现象和稀释效应。,2.等速电泳（ITP）考虑到分离室的宽度上，分别引入先导离子(具有最大电泳淌度的离子)，样品和尾随离子(具有最小电泳淌度的离

14、子)，在电场影响下，各种离子根据它们的电泳淌度差别重新按序排队，具有较大淌度的离子则靠近先导离子，具有较小淌度的样品则落在近尾随离子一侧，从而达到分离。,等速电泳是代替层析的电泳对应物。其分离过程达到稳态的时间与所加电压的大小成反比；与混合物中各组分的电泳迁移率差异的大小成反比；与样品的浓度大小则成正比。,等速电泳的分辨率适中，样品带的扩散效应较小，但是由于整个合适的分离体系的建立与要有一定的经验，而且其设置和操作都比较复杂，等速电泳在蛋白分离纯化方面的应用远没有其他几种分离模式那样广泛。,3.等电聚焦（IFE）等电聚焦是应用比较成熟的一种分离手段，商品化的两性电介质在15道输入口进入分离室，

15、然后在电场下形成一个天然pH梯度，当样品引入分离室后，各自迁移到它们的等电点(pI)的pH范畴上停滞不动而聚焦,也可用不同pH的缓冲液形成一人工矫作的pH梯度而聚焦，然后将随液流在出口的一定位置处流出。,在连续自由流电泳中，IEF的设置与一般的经典操作有所不同，可以多种方式在分离腔内形成pH梯度。一种是直接将具有较低电泳迁移率的不同两性电解质混合物的溶液泵入分离腔内，在电场的作用下，形成一个天然的连续型pH梯度；另一种则是在不同的输入口以平行的方式同时泵入不同pH的几种缓冲液，从而形成一人工的不连续的pH梯度。,由于等电聚焦过程中有样品的聚集和浓缩效应，自由流电泳中所固有的条带扩散现象相对较小

16、，因而常常用来作为进一步纯化样品的一个步骤。等电聚焦的产率较低，还受到要使用两性电解质的限制，但是，制备型自由流等电聚焦一起的出现解决了进样量不大的问题。,4.电场梯度电泳(FSE)在这种工作模式中，几种不同的分离缓冲液同时进入分离室，这些分离介质彼此相毗邻而各自清晰地通过分离室。它们主要由离子浓度不同而可异，有时也因pH而异。要分离的样品则常溶解在低离子浓度的介质中，在加上电场后，低离子浓度的区域的场强高于高离子浓度区域的场强，欲分离的物质根据其电荷而很快地形成条带而分开,FSE的一个显著特点就是它的物料流通量很高，另一个特点就是在不同电导区的边界处有很强的浓缩效应。在FSE中虽然浓缩效应可

17、使样品带的扩散受到限制，但其分辨率比之区带电泳还是要低不少。在这种分离模式中，奋力结果的好坏与样品的处理有关。另外，由于浓缩效应剧烈时会引起沉淀现象，因此对样品的起始浓度亦有一定的限制。,5.联合模式 所谓的联合模式就是将前述的几种分离模式相互联合起来使用，其中最常见的就是联合的电场梯度区带电泳（FSE/ZE）其分离原理与电场梯度电泳类似。这种联合模式具有比电场梯度电泳高的分辨率，同时其中的条带扩散现象却比区带电泳要小，而且产率适中，对于分离成分不太复杂的混合物有一定的优点。,四 应用,尽管连续自由流电泳存在热对流等诸多影响因素，但由于它具有其它分离方式所没有的液相“自由”分离特点，对样品生物

18、活性的影响很小，故其应用范围非常之广，从小分子，蛋白质，蛋白质-脂类复合物，DNA，染色体，脂质体，各种膜物质，细胞器到完整的细胞，都能通过这种方法分离。,1.小分子 连续自由流电泳首先可用于纯化经离子对色谱分离后的物质，经过分离的样品可直接用于红外，核磁共振和质谱分析。2.蛋白质 连续自由流电泳的一个较大的应用领域是用于蛋白质的分离纯化。比如从酵母提取液中用自由流电泳初步纯化醇脱氢酶，制备量是每小时处理2.7g，提纯4.7倍，产率90。,3.一些特殊物质 比如，Hayes等从脑垂体中分离纯化了含有生长激素的胞质分泌颗粒；Spaans等则用自由流电泳纯化了猪胰酶原颗粒；Engering等还用自

19、由流电泳等电泳方法对第二类主要组织相容性复合物进行了分离和组成研究。,4.膜物质 连续自由流电泳的另一个较广的应用领域是对膜物质（memberane vesicle）的分离纯化。Morre等对此进行了较深入的研究，并提出了对这些膜物质进行分离的理论基础，即溶液中膜物质外部的Stern层和Debye-Huckel层结构。,5.细胞 由于生理环境所要求的苛刻性及生物活性保持的困难性，使得常用的一些分离方法如色谱，凝胶电泳等，在分离细胞时都显得无能为力。常用的细胞分离方法如密度梯度离心和超离心，其分辨率都不高，而流式细胞仪奋力方法尽管分辨率尚可，却产量较低。而不同的细胞其表面的负电荷密度一般都有差异

20、，所以可用自由流电泳进行分离。,而且，对于进行大量的细胞分离，只有自由流电泳才能满足其在分辨率和产量上的要求。同时，自由流电泳还由于其无固体支持介质分离体系，温和的分离条件，可控的连续分离过程等显著优点而受到细胞学家和生化学家的青睐。人们已开展地基和空间的细胞分离研究工作。,6.在蛋白质组学中的应用 在蛋白质组学中，就技术而言，经典的双向电泳/质谱系统仍然是主要的手段，多维色谱或色谱/电泳结合也在发展之中，自由流电泳在蛋白至预分级中，也可起到一定的作用。,连续自由流电泳在新型蛋白质组研究学中能弥补目前蛋白质组主流分流技术-双向凝胶电泳的一些不足之处，在分离难溶的膜蛋白和复杂蛋白质混合物以及低丰

21、度蛋白质等方面发挥其独特的优点。,7.在空间微重力下分离蛋白质和细胞 前面已涉及很多在微重力下分离细胞和药用蛋白质方面的应用，如美国CFES对生长激素和一些蛋白质，细胞的分离。,实用举例：,五 结语,连续自由流电泳的发展走过了一段较长道德路程,从最初的简陋分离装置发展到现在的现代化全自动仪器,其应用范围也几乎已遍及生物学,生物化学和细胞学的各个领域。尽管自由流电泳分离过程中的影响因素不可能全部消除，但人们对此已做了许多仪器上和方法上的有益改进，可使其对分离的影响减至较低的程度。,而且，自由流电泳中独特的无固体支持介质分离系统，温和的分离条件，连续的分离过程以及较大的分离能力，使其他一些分离方法所不能比拟的。在空间进行的自由流电泳的实验结果对许多生化学家来说是极具吸引力的。完全有理由相信，自由流电泳必将随着其自身和科学的发展而发挥越来越大的作用。,Thank you!,