724172001生物大分子的分离纯化及其应用.ppt

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1、生物大分子的分离纯化及其应用,cly,Biomolecule,生物分子,泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。,包括,生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）,小分子（如脂类、激素、维 生素等）,生物大分子,生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。一般分子量从几千到几百万。,它们广泛存在于各种生物体内，与各种生命活动息息相关。除了天然存在的外，还有生物工程培养和发酵的。生物大分子具有十分重要的生理功能和应用价值。研究生物大分子的结构、功能及应用已成为生命科学的一个关键问

2、题。不论从动植物和微生物体内提取或用生物工程 制备的生物大分子产品，都是组成十分复杂的混合物，在使用前都要分离和纯化。,制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间理化性质的差异。,根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。（5）根据配体特异性，如亲和层析。,影响提取效果的因素,（1）pH值,（2）盐浓度（即

3、离子强度）,（3）温度,（4）水解酶,（5）搅拌与氧化,（6）有机溶剂,（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备；（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响；,生物大分子的分离纯化有以下主要特点：,（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十步的操作才能达到所需纯度；（4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。,蛋白质的分离纯化,生理学提及蛋白质的功能：(1)构成组织与修补组织；(2)构成酶和某些激素的成分；(3)增强机体抵抗力，构成抗体；(4)调节渗透压；(

4、5)供给热能。,蛋白质具有广泛的功能性质，每一种性质都会给食品及其加工过程带来特定的效果。具有生理活性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面已必不可少，在医疗和食品领域已逐渐得到应用。如可将功能蛋白质如乳清蛋白、蛋清蛋白、大豆蛋白等添加到食品中制得各种功能性食品。正是由于蛋白质与人类生活密切相关，所以对其质量和纯度要求也越来越高。,蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学组成、结构及生物学功能、新蛋白质的发现和疾病分子诊断的基础；分子克隆中，下游的处理和分析鉴定，基因工程产品的制备，也需要蛋白质的分离和纯化。蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度，以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性以达到目的

5、，即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。,分离纯化的总体原则 一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性；二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求,纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高。,蛋白质分离纯化的条件,蛋白质是一类结构复杂、有生物活性的生物大分子，离开天然的存在体系，其结构与活性变得极不稳定，因此从生物材料中提纯各种靶蛋白均需要特定的条件，应注意各种因素对靶蛋白的影响。,缓冲液 盐、金属离子和螯合剂.3.还原剂 4.去垢剂5.增溶剂 6.蛋白酶抑制剂（pronase inhibitor）7.蛋白质的环境因素 表面效应的影响温度的影响储存,蛋

6、白质常存在于复杂的混合体系中，且稳定性较差，对温度、pH、机械剪切力等非常敏感、易于变性。传统蛋白质的分离方法有吸附沉淀、溶媒、萃取、离子交换法等，这些工艺往往繁杂，提取时间长，消耗大量原料，能耗高。随着生物技术的发展和对各种蛋白质结构和功能研究的深入，对蛋白质分离检测研究也有了迅速发展，出现了许多高效的分离纯化技术和手段，主要包括膜分离、高效液相色谱，毛细管电泳、分子印迹技术及联用技术。,生物样本,蛋白质的释放（粉碎组织、裂解细胞）,离心,蛋白质粗提取液,盐析,有机溶剂沉淀,等电点沉淀,超速离心,蛋白质粗品,离子交换,凝胶过滤,亲和层析,制备HPLC,电泳,蛋白质纯品,预处理,分离,纯化,蛋

7、白质分离纯化的一般技术路线,1.离心技术简介,应用强大的离心力，使物质因沉降速度不同而进行分离的方法叫离心技术。常用方法：差速离心，密度梯度离心和等密度离心。,1.1差速离心 在离心管中进行，样品在离心时受离心作用移向离心管底部。,不同物质其大小、比重和形状不同而沉降速度不同。在相同离心力的作用下，沉降速率大的先沉到底部。,注：沉降速度相差越大越能得到良好分离。只能是一种粗分技术，多次重复操作是可以改善回收纯度的。,1.2 密度梯度离心,用来分离沉降速度差不太大的颗粒。方法：将小量样品置于一个从上而下密度变大的密度梯度液上进行离心。若物质比溶剂重，物质才下沉；若物质比溶剂轻，则物质浮在其上面。

8、所以在密度梯度液上面的样品物质，在离心时各物质按其沉降速率的不同而沉降，到最后按各自的比重平衡停留在相应密度的溶剂中。,又叫速率区带离心法,1.3离心技术的应用 可以用于制备，也可以用于分析。样品量可大可小，小到0.2ml以下，大到几千升。分离的对象广，包括各种亚细胞物质，各种蛋白质和酶，核糖核酸及其他一些生物大分子。,2.膜分法,又称超滤，以分子大小及形状差异为依据的方法。利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择

9、切向流过滤得到更理想的效果。,膜分离技术在蛋白质的分离纯化方面具有非常广阔的应用前景，并向工业化发展。e.g：学者用分离技术处理大豆乳清废水，以超滤膜截流分子，几乎可以回收所有多肽和蛋白质，再用纳滤膜进行浓缩，回收了蛋白质、低聚糖，又大大降低了废水排放量，取到了满意效果。,它也存在一定的问题，如在操作中膜面会发生污染，使膜性能降低，故又必须采用与工艺相适应的膜面清洗方法；而且单采用膜分离技术效果有限，因此有时需将膜分离工艺与其他分离工艺组合起来应用。但是可以预见，随着膜分离技术的进一步发展，其势必将取代那些耗能大、费用高、处理不彻底、周期长、易造成环境污染的传统单元操作，如沉淀、离心、过滤等，

10、并使产品成本降低，质量提高。,3.盐析法：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。4.等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。5.有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。,6.高效液相色谱法,已成为蛋白质物质快速分离纯化和分析的强有力手段，利用HPLC不仅可以在短时间内完成分离的目的，而且还可制备生物活性多肽，因此分离纯化和制备条件的选择目前已成为学者研究的热点。蛋白质在物理、化学及功能上的差异为蛋白质的分离检测

11、提供了基础，根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、功能等特性，以及蛋白质的来源、实验要求等，可以选择不同的模式来分离目标蛋白。,（HPLC）,6.1 反相高效液相色谱,分离机理 蛋白质的反相色谱中：用非极性的反相介质为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。在水溶液中，疏水性基团有避开水而亲合其他疏水性基团的倾向，即溶质分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填料（疏水性配基）的亲合。不同的蛋白质在相同流动相中

12、由于疏水基团多少、种类以及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到分离。结果：疏水性强的蛋白质亲合力大,出峰迟;疏水性小的蛋白质就容易被洗脱。,（RP-HPLC）,图 1人的胶原蛋白I型1和2键的色谱分离,e.g:,其分离蛋白质和酶等生物大分子具有速度快、分离性能好，重复性好，溶剂和流动相易除去等优点。在所有的液相色谱法中反相色谱的分离性能最好。但最大的缺点是很多蛋白质或酶在分离过程中失活，而且回收的样品中总含有有机溶剂。,6.2 离子交换色谱,是最早被用于蛋白质分离的一种方法,其是根据蛋白质分子在一定pH和离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。其原理为以离子交换树脂作为固定相，

13、树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。,(IEC),这种技术已经成功地应用于分离大多数的水溶性蛋白质，还广泛用于大豆多肽的分离纯化。由于大豆多肽在一定pH和离子强度条件下带电有微弱的差异，和离子交换剂靠静电力结合在一起时，进入介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子就会发生交换的差异而分离。,离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两大类：采用阴离子交换色谱分离乳蛋白时，一般是有针对性的分离某一种蛋白质时的效果较好，如分离骨桥蛋白时，纯度可以达到85%以上。

14、对于乳品中一些等电点较高的蛋白质，如乳铁蛋白，采用强阳离子色谱的分离手段则更为有效。,6.3凝胶过滤层析,凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。,它具有分离条件温和，产品收率高，生物活性好，分离面宽等优点，广泛用于蛋白质或多肽物质的分离纯化中。,7.电泳,电泳：带电粒子在电场作用下向着与其自身所带的电荷相

15、反的电极的移动。电泳技术：样品以一支持物为载体，在一定的电解质溶液中，各组分在电场的作用下，以不同的速度进行迁移，从而得到分离。电泳技术分类：按支持物的不同，分为：凝胶电泳、纸上电泳和薄膜电泳等。按操作原理分为：一般电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和免疫电泳 等。对分离物的要求：在介质中必须带电。,7.1凝胶电泳,7.1.1原理：不同带电粒子在同一外加电场作用下泳动的速度是不同的，泳动度取决于带电颗粒的性质，颗粒所带净电荷越多、直径越小，越接近球形、泳动速度越大。此外，还与介质PH值（蛋白质为两性电解质，有一等电点，在不同pH值下所带净电荷的符号及数量均不同，在电场中的泳动速率也就不同了）、电场强

16、度（电场强度越高，粒子泳动速度越快）、离子强度（介质离子强度越大，粒子的泳动越慢。一般在0.02 0.2之间）、电渗等实验条件有关。,主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳,7.1.2丙烯酰胺凝胶电泳的优点,具有很高的分辨率。大小不同的分子在通过网状结构的凝胶的空隙泳动时受到的阻力不同，大分子物质受到的阻力比小分子的大。这样就使聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重功能，提高了分辨力。凝胶空隙的大小可以人为地调节，以适应不同分子量的样品。聚丙烯酰胺凝胶电泳中电渗现象很小。凝胶机械强度较好，弹性大，易保存。丙烯酰胺可以提得很纯，不会污染样品。,聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的是平板电泳仪。装置见下图,7.1.3凝

17、胶电泳的应用,广泛用于分离蛋白质、酶和核酸等生物大分子及其他带电的有机物。生物大分子的分离及分子量测定:样品组分在电泳中按照其带电情况和分子大小不同而有不同的迁移率，在胶板上得到分离。在 SDS不连续凝胶电泳中，样品组分按分子量大小排列，分子量的对数与迁移率之间有一个线性关系。因此在电泳时加入标准分子量的蛋白质标准样，可以测定未知样的分子量。样品组分的回收:凝胶电泳可以作g级样品的分离制备。回收样品组分的方法有：扩散洗脱和电泳洗脱。,7.2毛细管电泳,毛细管电泳是继高效液相色谱之后，将电泳技术和色谱技术相结合的一种新的分离技术。它是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌

18、度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在高压作用下，带电粒子在毛细管内的溶液中迁移，迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和。各种粒子因迁移速度不同而实现分离，具有分离率高、快速、用量少等优点，是分离蛋白质及相关氨基酸和肽的有效工具。,(CE),七种分离模式：毛细管区带电泳(CZE)、胶束电场毛细管电泳(MECC)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等点聚焦(CIEF)、毛细管电色谱(CEC)、亲和毛细管电泳(A毛细管电泳)。,毛细管电泳在蛋白质分离分析中的应用主要包括：肽和蛋白的鉴别分析、结构分析、微量制备，以及蛋白的定量测定、纯度检测、非均一性检测、稳定性和动

19、力学研究。有学者对240例异常蛋白质血症患者标本使用多通道毛细管电泳与琼脂凝胶电泳对照，结果显示毛细管电泳检出异常蛋白质敏感性高，且诊断结果一致。,7.3等电聚焦电泳,通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。,（IEF）,常用的蛋白质分离纯化方法,8.联用技术,蛋白质的种类很多，大多具有相似性，使用单一的分离纯化手段已经不能达到理想的效果。毛细管电泳分离纯化效果好，但也存在处理样品少、不能进行制备等缺点，而HPLC可以进行大规模制备，特别是反相高效色谱RPLC具有分离效果好，分辨率高，回收率高，但费时、价高等特点，因此联用技术在多肽分离纯化中已显示出巨大的优越性。,参考文献,1高素莲,周

20、宁国.现代分离纯化与分析技术M.北京.中国科学记住大学出版社,2004.2王海涛,林进.化学分离提纯技术M.北京.化学工业出版社,2012.3徐跃飞,孔英.生物化学与分子生物学实验技术M.北京.科学出版社.2011.4傅小伟,金益英,周石磊,等.蛋白质分离纯化技术研究进展J.广东化工,2011,38(216):35-36.5 张秀敏,张曼.毛细管电泳分离技术的进展及其在蛋白质分离中的应用J.标记免疫分析与临床,2009,16(5):3216-328.6 戴勇.分子印迹技术在多肽、蛋白质分离中的应用J.盐城工学院学报:自然科学版,2003,16(4):46-49,Thanks for your attention!,The end,