品种纯度室内测定.ppt

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1、,品种真实性及品种纯度的室内测定,第一节 品种纯度室内测定概述,品种真实性和纯度是保证良种优良性状充分发挥的前提，是正确评定种子质量的重要指标。品种真实性和品种纯度检验在种子生产、加工、贮藏及经营贸易中具有重要意义和应用价值。本章主要介绍品种真实性及品种纯度的含义及室内常用的测定方法。,一、品种纯度的含义品种真实性是指一批种子所属品种、种或属与文件描述（description）是否相符。如果品种真实性有问题，品种纯度检验就毫无意义了。品种纯度是指品种个体与个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数（或株、穗数）占供检验本作物样品数的百分率表示。,二、品种纯度检验的方法分类 依据检验

2、对象不同：种子纯度测定、幼苗纯度测定、植株纯度测定；根据检验场所不同：田间纯度检验、室内纯度检验和田间小区种植鉴定,根据原理不同：形态鉴定、物理化学法鉴定、生理生化法鉴定、分子生物学方法鉴定、细胞学方法鉴定；根据检验方法的原理分类是品种纯度检验中较为公认的分类体系.,第一大类形态鉴定，又分为籽粒形态测定、种苗形态测定和植株形态测定。,籽粒形态测定根据种子形状、大小、色泽、质地、表面的光与毛以及种子外表各部位的特征来加以鉴别，以区分本品种与异品种。该法简单、经济、快速，但准确性较差，且随着现代育种科学的发展，不同品种间种子外观形态的差异越来越小，因此靠区别种子形态上的差异来鉴定种子纯度也变得越来

3、越困难。,种苗形态测定适合于幼苗形态性状丰富的作物，如十字花科、豆科等双子叶植物，比如油菜的子叶形状（心脏形、肾脏形、叉形）、大豆苗期的胚轴色（绿色、浅紫色、深紫色）和叶形（卵圆形、披针形、三角形、圆形）等。种苗测定需要的时间一般在730天，因苗期所依据的性状有限，所以测定结果不太准确。,植株形态测定是在成株期依据株形、株高、叶片数、叶色、叶片宽窄、花药颜色等主要特征鉴定纯度，依据的性状较多，测定结果较准确，这是目前最为通用的且比较可靠的方法。田间纯度检验和田间小区种植鉴定都属于植株形态测定，但此法所需时间较长，当年所生产的种子要等下一个生长季节或异地鉴定才能得到结果，往往丧失商机，且费工占地

4、。,第二大类物理化学法鉴定，又分为物理方法和化学方法,物理方法如荧光鉴定法（fluorescence test）等，这些方法区别品种的种类较少，难以满足品种纯度准确测定的要求。化学方法（chemical method）主要依据化学反应所产生的颜色的差异区分不同品种，如苯酚染色法（phenol test）等。同物理法一样，化学方法区别品种的种类较少，也难以对品种纯度准确测定。但这类方法测定速度快，在实践中有一定的参考价值。,第三大类方法生理生化方法，是利用生理生化反应和生理生化技术进行品种纯度测定。,这类方法中包括的技术较多，以生理生化反应为基础的有愈伤木酚染色法，光周期反应鉴定法，除草剂敏感性

5、鉴定法等。这些方法鉴别品种的能力较低，因此，测定结果不太准确。以生理生化技术为基础的方法有电泳法鉴定,色谱法鉴定,免疫技术鉴定等。,色谱法技术含量较高，免疫技术需要大量技术开发研究，目前两者难以在生产实际广泛应用。电泳法相对技术较为简单，依据蛋白质或同工酶电泳，可以相对较准确地测定品种纯度，是目前品种纯度测定中较为快速准确的方法。,第四大类细胞学方法鉴定细胞学方法主要依据染色体数量和结构变异、染色体带型差异以及细胞形态的差异区分种及品种，在品种纯度测定中应用价值不大。,第五大类分子生物学方法。分子生物学方法种类非常多，它是在DNA和RNA等分子水平上鉴别不同品种。,目前在品种检测中最常用的分子

6、技术主要有RAPD技术，SSR技术，AFLP技术以及RFLP技术。分子技术在品种纯度测定和品种DNA指纹的制作方面具有广泛的用途。,三、室内纯度测定的基本程序室内纯度测定的基本程序：从送验样品中随机数取(分取）一定数量的样品，测定异品种种子数或杂株数，再计算样品纯度。品种纯度测定的送验样品的最小重量应符合表16-1的规定。样品纯度按下列公式计算：,表16-1 品种纯度测定的送验样品重量,有时需要将测定结果与规定值比较。测定的结果（x）是否符合国家种子质量标准值或合同、标签值（a）要求可利用表16-2判别，如果a-x容许差距，则说明不符合国家种子质量标准值或合同、标签值要求。表中的容许差距，可以

7、通过下列公式计算：,式中：T为容许差距；p为标准或合同或标签值；q为100p；n为样品的粒数或株数。,表16-2 品种纯度的容许差距（5%显著水平的一尾测定）P225,第二节 品种纯度的形态测定,品种纯度的形态测定是检验人员借助放大镜、解剖镜等工具，依据某一作物品种不同于其他品种的特定的外观形态特征来进行鉴定的方法。是纯度测定中最基本的方法，又可分为籽粒形态测定、种苗形态测定和植株形态测定。因其依据的形态性状的多少、差异大小和可靠性，而影响测定结果的可靠性。,一、籽粒形态测定籽粒形态测定特别适合于籽粒形态性状丰富、籽粒较大的作物。在测定时特别应注意因环境影响易引起变异的籽粒性状，同时该方法易受

8、主观因素的影响。这一技术可以与计算机识别相结合对品种真实性和纯度进行快速测定，消除主观影响。,（一）测定方法,按照ISTA和GB/T3543规程，随即从送验样品中数取400粒种子，鉴定时需设重复，每个重复不超过100粒种子。根据种子的形态特征，逐粒观察，必须备有标准样品或鉴定图片和有关资料。,（二）测定所依据的形状,玉米种子根据粒型（马齿形、半马齿形、硬粒型）、粒色（白色、黄色、红色、紫色）深浅、粒顶部形状、顶部颜色及粉质多少、胚的大小、形状、胚部皱褶的有无、多少、花丝遗迹的位置与明显程度、稃色（白色、浅红、紫红）深浅、籽粒上棱角的有无及明显程度等进行区别。,区分杂粒时可以根据粒形和稃色。稃色

9、呈红色的有正交掖单2号、沈单7号、丹玉13号、鲁原单14号、鲁玉14号、鲁单50号；稃色呈白色的有反交掖单2号，掖单4号、12号、13号、19号、22号，鲁玉10号、16号，西玉3号等。区分自交粒时主要依据的是粒色和籽粒顶部颜色。一般粒色与顶部颜色为深色的母本粒色与顶部颜色为浅色父本的杂交种籽粒和顶部颜色变浅。例如：掖单2号、4号，鲁玉10号、16号，鲁原单14号等。母深色父浅色的杂交种颜色变浅。例如：烟单15号，掖单12号、13号、22号，反交掖单2号，西玉3号等。有的品种父母本籽粒顶部颜色都呈浅色或都呈深色，较难区分，例如农大60号、农大65号、中单2号、丹玉13号等。除粒色和顶部颜色外，

10、杂交种的粒形、稃色、棱角、花丝遗迹、胚部性状等均由母本基因控制与自交粒，没有区别。,小麦种子根据粒色（白、红）深浅、粒形（短柱形、卵 圆形、椭圆形、线形）、质地（粉质、角质）、种子背部性状（宽窄、光滑与否）、腹沟（宽窄、深浅）、茸毛（长短、多少）、胚的大小、突出与否、籽粒横切面的模式、籽粒的大小等性状。,大豆种子可根据种子 大小、形状（球形、扁球形、扁椭球形等）、颜色（黄、青、红、褐、黑）深浅、光泽、脐色（黄、青、浅褐、褐、深褐、黑色）、脐形状（圆、椭圆、倒卵圆、肾脏形）等性状。,棉花可用分梳法测定 棉纤维的长度，计算 纤维整齐度。纤维整 齐度用纤维平均长度2mm以内的棉籽数占总粒数的百分率表

11、示。此外棉花还可用杂籽百分率表示。,操作方法：1、分梳法 取样：每品种取每瓢中部籽粒1粒，共取10-20粒；分梳：以种子的脊为中线，向左右分开棉纤维，梳成碟形，先用稀齿梳通，再用密齿梳，尽量避免梳落纤维；贴板：梳齐梳平后，轻轻拉住纤维两端，紧贴在黑绒板上（籽粒尖端向下）；测量：用尺子在纤维两端多数纤维的终点向内移半个种子宽度处刻划一印，以此为界，量两边共有长度（mm），用2除之即得其长度。计算平均值。2、手扯测量法,二、生长箱测定生长箱测定可用于幼苗和植株形态测定。该方法可保证全部幼苗和植株都生长在同样的条件下，其品种形态特征的差异是遗传基础的表达。,生长箱测定，可采用两种方法：第一种方法，给

12、予幼苗加速生长发育的条件，可以鉴定如田间植株一样的许多性状，而大大缩短测定时间。第二种方法，将种子或植株种植在特殊逆境条件下，可对品种进行逆境反应差异的鉴定。,幼苗和植株鉴定 关于幼苗和植株性状的鉴定方法列于表16-4。（1）玉米、高粱 可在出苗后第14天进行玉米、高粱幼苗芽鞘和顶端颜色鉴定。芽鞘颜色可分为紫红色或绿色。顶端颜色可能有4种类型：深紫色(在茎和叶的近轴和远轴表面全深紫色)、中等紫色(紫包茎，近轴叶表面几乎深紫色，但远轴叶表面为黄棕色)、浅紫色(幼苗在茎和叶边缘有局部紫色，主要为绿色)和绿色(幼苗完全绿色)。如利用比建议较低的光照强度，也可能用于区分品种，以及鉴定异型株。,（2）大

13、麦 播种10天至2周可以鉴定胚轴或叶鞘花青苷。播种3-4周可以鉴定品种间的胚轴长度和株高差异。播种4-6周，大麦品种可以记录抽穗（春大麦）或不抽穗（冬大麦）。春性品种还可以评定穗上的芒颜色（红或绿）和其它性状。这些观察可作为品种分类，也可作为鉴定异型株。（3）小麦 小麦幼苗的芽鞘和茎色的鉴定，可在播后大约第7天进行。其颜色可分为紫色和绿色。抽穗情况的记载可在出苗后30天左右进行。抽穗情况可分为正在抽穗(春小麦)、未抽穗(冬小麦)。该法可用于区分品种，及检出异型株。,（4）十字花科 在子叶期根据子叶大小、形状、颜色等性状鉴别。第一真叶期根据第一直叶形状、大小、颜色、茸毛多少、长短、叶脉宽窄及颜色

14、、叶缘特性等鉴别。将种子播于砂盘内，粒距1cm，2025培养。发芽7天后鉴定子叶性状，1520天鉴定真叶性状。（5）莴苣 可以根据幼苗的下胚轴颜色(粉红色或绿色)、第一叶叶色(红、粉红、浅绿或深绿)、叶缘(深裂、全缘或浅裂)、叶卷曲(似管形或展开)、子叶形状(宽或窄)等性状进行鉴定。鉴定时期为播种后三周或三至四叶期。该法可用于栽培品种分类和鉴定异型株。,（6）菜豆 菜豆品种的植株可依据花色(紫色、白色花)和从播种至开花的天数进行鉴定。从播种至开花大约需46周鉴定。该法可用于区分栽培品种和检出异型株。（7）燕麦 可在播后第1014天对燕麦幼苗的芽鞘和叶鞘颜色(红色或绿色)和叶鞘茸毛进行鉴定。其幼

15、苗可按茸毛有无，光滑或混合(有些幼苗光滑，而有些有茸毛)进行分类。该记载可在播后30天进行。燕麦植株也可进行抽穗(春燕麦品种)或不抽穗(冬燕麦品种)检查。该检查可用于区分栽培品种，并附带检出异型株。,（8）洋葱 出苗后几天，在砂上长出的部分可评定为红叶或绿叶。播种后四周，检查是否形成球茎，记录从播种至球茎形成的时间。在球茎形成时记录株高和球茎(而葱不形成球茎)。播种后12周，在容器中生长的植株至少17 cm，检查球茎的形状和颜色、叶姿和叶蜡。该法可用于栽培品种分类和鉴定异型株。,（9）大豆 大豆幼苗花青素鉴定，可在播后第1014天进行。如果幼苗是培育在原来说明的条件下，则可能观察到4种苗色：绿

16、色(仅有绿色素)、赤褐色(下胚轴下部有赤褐色素)、淡紫色(下胚轴紫色，上胚轴绿色)和深紫色(上胚轴和下胚轴均为紫色)。同时在播后第21天，待3片小叶完全展开时，可进行上面一片小叶背面茸毛角度的鉴定。小叶茸毛角度可分为直角、紧贴、中等；茸毛颜色可分为黄褐色、灰色；小叶形状可分为卵形(长宽比少于1.6)、尖形(长宽比大于2)。该法适用于区分品种和检出异型株。,第三节 品种纯度的快速测定,在品种纯度的测定中通常把物理法鉴定、化学法鉴定等在短时间内测定品种纯度的方法归为快速测定方法。本节将以国际标准和国家标准为依据介绍部分快速品种纯度测定方法。,一、苯酚染色法（一）苯酸染色法的机理苯酶染色法已作为IS

17、TA和我国国家标准。苯酚染色法的机理有两种观点，一种认为是酶促反应，另一种认为是化学反应。该反应可受Fe+、Cu+等双价离子催化，加速反应进行。Na+离子（NaOH、Na2CO3）对该反应有抑制作用。其反应可用下式表示：,（二）苯酚染色的方法1麦类（1）国际标准法 随机选取适量净种子，放于容器中（烧杯、试管、培养皿），加水在室温下浸泡1824小时。注意：水最好用蒸馏水或优质自来水；高温条件下注意换水或在冰箱里浸泡，以防种子发霉变质。数取浸泡好的种子400粒，每重复100粒。（这里要将损伤粒、虫蛀粒、不完整粒剔除掉）。,用滤纸吸干表面水分，均匀摆放在垫有1%苯酚溶液湿润滤纸的培养皿内（腹沟朝下）

18、。室温下小麦保持4小时，燕麦2小时，大麦24小时后即可鉴定染色深浅。小麦观察颖果颜色，大麦、燕麦观察内外稃的颜色，一般染后的颜色可分为不染色、淡褐色、褐色、深褐色、黑色五种，将与基本颜色不同的种子取出作为异品种。,（2）快速法 将小麦种子用1.0%的苯酚浸15分钟，取出放在铺有1%苯酚湿润过的滤纸的培养皿中（腹沟朝下），并盖上贴有同样滤纸的培养皿盖。置3040温箱内，染色0.51小时，观察染色结果，区分本品种与异品种。,注意事项：1、受损伤籽粒不宜作为染色鉴定的样品，因为损伤处不染色，影响鉴定结果。2、有些品种需要延长染色时间，因为有的品种染色结束后，颜色的分组任然很难进行，有中间渐变类型，这

19、时关键要看有无颜色断层。无断层的可延长染色时间，增加观察次数，延时染色结果结合标准时间染色结果。3、有些品种利用标准法染色后，颜色相同无法区别。可采用加速或延缓剂处理后再染色鉴定。对染色很深的种子，用0.3%碳酸钠溶液浸种18小时（室温）；对染色很浅的种子利用0.01%硫酸铜溶液浸种18小时，然后置培养皿内染色。,4、配好的苯酚溶液装入棕色溶液瓶，在冰箱中保存，放置时间不超过3个月。经包衣或杀虫剂、杀菌剂处理的种子，视情况延长染色时间。5、苯酚染色是利用蒸气进行的染色反应，并非溶液反应，所以染色时要求相同大小的培养皿，药液加入量要一致，以保证各个重复间苯酚蒸气浓度相同。6、苯蒸气有毒，实验室要

20、保持通风良好，实验人员最好有一定的防护措施。,2水稻 将种子浸水6小时，取出放入1%苯酚溶液中，室温下12小时，然后取出用清水洗涤，放在湿润的滤纸上24小时，观察谷粒或米粒染色程度。谷粒染色分为不染色、淡茶褐色、茶褐色、黑褐色和黑色五级，米粒染色分为不染色、淡茶褐色、褐色三级。,二、愈伤木酚染色法（一）愈伤木酚染色的原理 愈伤木酚（C7H8O2）是专门用于大豆品种鉴别的方法。Buttery和Buzzell（1968）根据大豆种皮内过氯化物酶活性的高、低，把大豆品种分为两大类。其原理是：大豆种皮内的过氧化物酶，可催化过氧化氢分解产生游离氧基，游离氧基可使无色的愈伤木酚氧化产生红褐色的邻甲氧基对苯

21、醌，种皮内含有的过氧化物酶活性越高，单位时间内产生的红褐色的邻甲氧基对苯醌越多，溶液的颜色越深。反之，颜色越浅。不同品种由于遗传基础不同，过氧化物酶的活性不同，在一定条件下，溶液染色的深浅不同，依此区分不同品种。,公式,（二）愈伤木酚染色的方法 方法是将大豆种皮逐粒剥下，分别放入指形管内，然后注入1ml蒸馏水，在30下浸泡1小时，再在每支试管中加入10滴0.5%愈伤木酚溶液，10分钟后，每支试管加入1滴0.1%过氧化氢溶液，1 分钟后根据溶液呈现颜色的差异区分本品种和异品种。使用该方法时应注意，剥种皮时的碎整程度要一致，否则影响染色的深浅，进而影响测定结果。最好使用小的打孔器，将种皮打下，这样

22、克服了种皮大小及碎整程度的影响。,三、荧光分析法 紫外光能量较高，当照射物体时，就会产生光激发现象，被激发的电子很不稳定，由高能态转变为低能态时，便会发现一种可见光荧光。因作物和品种不同，其种皮结构和化学组成不同，在紫外光照射下发出荧光的波长不同，因而产生不同颜色。荧光分析可对种子或幼苗进行测定。,（一）种子鉴定 取净种子400粒，分为4次重复，分别排在黑板上，放在波长为360nm的紫外分析灯下照射，试样距灯泡最好为1015cm，照射数秒或数分钟后即可观察，根据发出的荧光鉴别品种或类型。,如蔬菜豌豆发出淡蓝或粉红色荧光，谷实豌豆发褐色荧光；十字花科不同种发出荧光不同：白菜为绿色，萝卜为浅蓝绿色

23、，白芥为鲜红色，黑芥为深蓝色，田芥为浅蓝色。,（二）幼苗鉴定 国际上主要用于黑麦草与多花黑麦草的鉴别。取试样二份，各100粒，置于无荧光的白色滤纸上发芽，粒与粒之间保持一定距离，于20恒温或2030变温培养。黑暗或漫射光，发芽床保持湿润，经14天即可鉴定。将培养皿移至紫外灯下照射，黑麦草根际不发光，多花黑麦草根际发蓝色荧光。羊茅与紫羊茅也可用同样的方法进行鉴定，但幼苗鉴定前发芽床上先用稀氨液喷雾，然后置于紫外灯下照射，羊茅根发蓝绿色荧光，而紫羊茅则发黄绿色荧光。,除以上三种方法外，还有：利用碱液处理区分红白皮小麦（GB/T3543小麦种子的氢氧化钠测定法），进行十字花科品种真实性鉴定；利用漂白

24、水处理，区分单宁含量不同的高粱品种（GB/T3543高粱种子氢氧化钾-漂白粉测定法）；利用I-KI溶液区分直支链淀粉含量不同的水稻品种；利用除草剂敏感性鉴定转除草剂基因大豆；利用抗生素基因，检测转基因作物等。这些方法仅仅依据个别性状或个别特性进行品种的检测，只能将品种区分成少数几类。,第四节 品种纯度的电泳测定,一、品种纯度电泳测定的发展电泳是指溶液中的带电粒子在电场中移动的现象。这一现象在19世纪就已发现，并用于胶体化学的研究中。直到1937年Tiselius开发了蛋白质电泳技术，并成功地用这种方法分离了血清蛋白之后，才使这一技术在生物研究中得到广泛地应用。,电泳技术的种类很多。根据有无固体

25、支持物，可分为两大类，即界面电泳和区带电泳。界面电泳是指在溶液中进行的电泳，没有固体支持物。由于这种方法易于互相重叠，且分离后不易收集，故目前已很少应用界面电泳。区带电泳是指在支持物上进行的电泳。根据支持物的不同，常用的区带电泳又可分为纸上电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳等。在生物研究中，支持物电泳用的最多，特别是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）因其凝胶透明度高、弹性好、无吸附性、浓度易控制，应用最为广泛。聚丙稀酰胺凝胶电泳又分为圆盘电泳和平板电泳两种，在品种纯度测定中主要应用平板电泳。,目前鉴定品种的常用电泳方法：（1）国际种子检验协会 鉴定小麦和大麦品种醇溶蛋白聚

26、丙烯酰胺凝胶电泳标准程序、鉴定豌豆属和黑麦草属的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准方法、超薄层等电聚焦电泳测定杂交玉米种子纯度的标准方法列入国际种子检验规程，在全世界推广应用。,（2）国际植物新品种保护联盟于1994年制订有关电泳技术标准将分析小麦高分子量麦谷蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析玉米同工酶的淀粉凝胶电泳方法列入DUS检测应用。,（3）我国GB/T 3543农作物种子检验规程已将ISTA规程的鉴定小麦和大麦品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照方法列入应用。2001年农业部颁布了“玉米种子纯

27、度盐溶蛋白电泳鉴定方法”（NY/T4492001）。,二、电泳法测定品种纯度的原理（一）电泳法测定品种纯度的遗传基础 电泳法测定品种纯度主要利用电泳技术对品种的同工酶及蛋白质的组分进行分析，找出品种间差异的生化和分子指标，以此区分不同品种。,目前品种鉴定主要以同工酶和蛋白质为电泳对象。同工酶是指同一生物体或同一组织中催化相同化学反应，结构不同的一类酶。从遗传法则（DNARNA蛋白质（或酶）知道，蛋白质或酶组分的差异最终是由于品种遗传基础的差异造成的，因此分析酶及蛋白质的差异从本质上说是分析遗传的差异，即品种差异，,利用先进的电泳技术可非常准确地分析种子蛋白质或同工酶的差异，进而区分不同品种，测

28、定品种纯度。由于某些同工酶在种子贮藏和萌发过程中，种类数目易随生活力和发育进程的变化而变化，加之种子萌发速度不一致，所以对品种纯度鉴定不利。此外，酶的提取和电泳条件较蛋白质要求严格，需在低温下进行。因此，在纯度鉴定的研究中，应以蛋白质为主。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 聚丙烯酰胺凝胶是聚丙烯酰胺通过交联剂（甲叉双丙烯酰胺，Bis）在催化剂的作用下聚合成的高分子胶状聚合物。其凝胶透明，有弹性，机械强度高，可操作性强；化学稳定性好，对pH、温度变化稳定；该凝胶属非离子型，没有吸附和电渗现象；并通过改变丙烯酰胺和交联剂的浓度可有效控制凝胶孔径的大小。因此，在品种纯度电泳分析中广泛应用。,蛋白质（

29、或酶）为两性电解质，在不同pH条件下所带电荷多少不同。不同的蛋白质（或酶）由于氨基酸的组成不同，其等电点pI也不同，在同一pH条件下所带电荷也就不同。因此在电场中受到的作用力大小也就有差异。聚丙稀酰胺凝胶电泳主要依据分子筛效应和电荷效应对蛋白质（酶）进行分离。,分子筛效应是指由于蛋白质分子的大小、形状不同在电场作用下通过一定孔径的凝胶时，受到的阻力大小不同，小分子较易通过，大分子较难通。随丙稀酰胺和交联剂浓度的增加，凝胶孔径变小，反之孔径变大。小孔径凝胶适于小分子蛋白质（或酶）的分离，大孔径凝胶适于大分子量蛋白质（或酶）的分离。,电荷效应是指由于蛋白质带的电荷多少不同，受电场的作用力不同，电荷

30、多受到的作用力大移动较快，反之，较慢。溶液的pH值与蛋白质的pI相差越大，蛋白质带电荷越多。蛋白质在凝胶中的运动速度与荷质比有着密切关系。经过一定时间的电泳，性质相同的蛋白质就运动在一起，性质不同的蛋白质就得到了分离。,描述蛋白质泳动速度一般用迁移率m或相对迁移率Rf值表示：m=dl/vt，m为迁移率（cm2/伏特、秒）；d为蛋白质谱带移动的距（cm）；l凝胶的有效长度（cm）；v电压（伏）；t电泳时间（秒）。,三、品种纯度电泳检测的一般过程,品种纯度电泳检测的一般过程电泳的方法很多，不同方法其具体操作过程也有差异，具体参见相应的标准和方法。在品种纯度电泳测定时一般包括：样品的提取、凝胶的制备

31、、上样电泳、染色观察等步骤。,应注意的是，电泳测定时，在不同混杂率的情况下，保证测定结果的可靠性所需要的样本粒数不同，可参考表16-5。,表16-5 电泳所需样品数量,谱带分析 谱带分析主要依据由于遗传基础的差异所造成的蛋白组分的差异区别本品种和异品种。杂种F1代表现为双亲共显性，即在父母本中所具有的蛋白质谱带，在F1同时显现，这种谱带成为互补带。,第十六章,玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法,NY/T449-2001,一、范围 本标准规定了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法 本标准适用于玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度鉴定,二、定义 种子真实性：供检品种与文件记录（如标签等）是

32、否相符。品种纯度：品种的特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子占供检本作物样品种子数的百分率表示。育种家种子：育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子，用于进一步繁殖原种的种子。,三、原理 从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效用作用下进行分离，通过染色显示蛋白质谱带类型。不同玉米品种由于遗传组成的不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。,四、仪器设备及试剂仪器设备 电泳仪、垂直板夹心式电泳槽、单籽粒粉碎器、天平、酸度计、磁力搅拌器、高速离心机、电冰箱、电炉、离心管、离

33、心管架、移液管、微量进样器、恒温箱、观片灯等。试剂 丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、乳酸、乳酸钠、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R250、无水乙醇、正丁醇等。,五、溶液配制 电极缓冲液 称取甘氨酸6.00g，倒入2000ml烧杯中，加入1800ml去离子水溶解，用2.0ml乳酸调至PH3.3，再加去离子水定容至2000ml，混匀。样品提取液 称取氯化钠5.80g，蔗糖200.0g，甲基绿0.15g，倒入1000ml烧杯中，加去离子水800ml溶解，加热至微沸，放至室温，再用去离子水定容至1000ml。在4条件下保存。,分离胶缓冲液 取1.43ml乳

34、酸钠于1000ml烧杯中，加去离子水980ml，用乳酸调至PH3.0，再加去离子水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，在4条件下保存。分离胶溶液 称取丙烯酰胺112.50g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺3.75g，抗坏血酸0.25g，硫酸亚铁0.8mg，用分离胶缓冲液溶解，再用分离胶缓冲液定容至1000ml，过滤于棕色瓶中，在4条件下保存（不超过14天）,浓缩胶缓冲液 取0.30ml乳酸钠于200ml烧杯中，加去离子水90ml，用乳酸调至PH5.2，再加去离子水定容至100ml，贮于棕色瓶中，在4条件下保存。浓缩胶溶液 称取丙烯酰胺6.0g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺1.00g，抗坏血酸0.03g，硫

35、酸亚铁0.8mg，用浓缩胶缓冲液溶解，再用浓缩胶缓冲液定容至1000ml，过滤于棕色瓶中，在4条件下保存（不超过6天）,3%过氧化氢溶液 取30%的过氧化氢1ml，加9ml去离子水，贮于棕色瓶中，在4条件下保存。染色液 称取考马斯亮蓝R250 2.0g，在研钵中用100ml无水乙醇研磨溶解，过滤于棕色瓶中。取10ml该溶液，加入到200ml的10%（W/V)三氯乙酸溶液中，混匀。,六、电泳操作样品提取 按GB/T3543.2的要求，从送验样品中随机数取（或分取）玉米种子至少100粒，单粒粉碎,放入1.5ml离心管,加与样品相同体积的样品提取液,摇匀,放置5-10min,再摇匀,30min后，用

36、离心机离心（5000r/min）15min,取上清液电泳.,凝胶制备 胶室制备 将玻璃板装入胶条中，把胶条固定在电泳槽内，保持水平，短板向正极，拧紧备用。封底缝 取适量分离胶溶液于烧杯中，加入适量3%的过氧化氢溶液，迅速摇匀，并从长玻璃外侧沿玻璃板倒入，振动电泳槽3次，静置。,灌分离胶 底缝封好后，取适量分离胶溶液，加入适量3%的过氧化氢溶液，迅速摇匀，将分离胶溶液倒入两玻璃之间，高度距短玻璃上沿1.2cm，迅速用适量的正丁醇封住胶面。待凝胶聚合后，用去离子水冲洗胶面3次，用滤纸吸干。灌浓缩胶 取适量浓离胶溶液，加入适量3%的过氧化氢溶液，迅速摇匀，倒入两玻璃之间，马上插好样品梳。,点样 浓缩

37、胶聚合后，拔出样品梳并清理样品槽，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液15ul，每点一粒后，用去离子水清洗进样器3次。点样时要注意，定量均匀，不要有气泡。上样前最好将样品先离心，否则造成电泳中常见的拖尾现象。,电泳 加样完毕后，倒入电极缓冲液，上槽电极液要高于短玻璃，下槽电极液要高于电极丝；将电源线正极接上槽，负极接下槽；接通电源，采用500V稳压进行电泳，待甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时，关闭电源。,染色观察 取出胶片，在30恒温条件下染色2-4h；观察。,七、结果计算电泳测定值 计数供检样品粒数和非本品种粒数,按下式计算电泳测定值,样品纯度值计算 将电泳测定值X代入回归方程，

38、计算出样品纯度值，将电泳纯度值与GB4404.1中的纯度值进行比较判定样品是否合格。,电泳中易出现的问题及对策1、凝胶聚合不好 通常凝胶聚合应该在15-30分钟。过快聚合表示催化剂用量太多，此时凝胶太硬易龟裂，且在电泳时易烧胶。聚合太慢，甚至不聚合，表示试剂配比不对，凝胶液放置时间过长，试剂不纯，温度偏低。2、分离胶不平整或凝胶内产生气泡 灌好分离胶之后没有加入正丁醇；灌胶速度太快。,3、电泳过程中不正常现象及对策 电源上没有显示电压，说明电源故障或电极丝断了。前沿指示剂向相反方向移动，说明电源连接正、负极措置或缓冲液选择错误。凝胶龟裂或与玻板分离，这主要是电流过大胶板过热造成的。谱带分离效果不好，大分子蛋白分离不好，凝胶浓度过高；小分子蛋白分离不好，凝胶浓度过低。电泳时间太短。谱带不整齐，主要是凝胶聚合太快，分离胶面不平或凝胶内有气泡。指示剂前沿呈现两边向上的曲线，即“笑脸”现象，说明凝胶冷却不均匀，中间部分冷却不好。如果指示剂前沿呈现两边向下的曲线，即“皱眉”现象，则常常是由于电泳槽装置不合适引起的，比如底部有气泡或凝胶聚合不均匀。,