09水处理生物学实验指导书.doc

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1、水处理生物学实验指导书凌 琪 王 莉 陶 勇2011年9月实验一 显微镜的使用及微生物形态的观察一、目的1学习普通光学显微镜的使用方法（本实验学习低倍镜和高倍镜的使用）。2通过对教学生物标本玻片或曝气池活性污泥的观察，认识微生物的形态。二、实验器材1教学生物标本玻片或曝气池活性污泥。2显微镜、目测微尺、物测微尺、载玻片、盖玻片等。三、实验步骤(一)显微镜的结构和各部分的作用图81所示，是微生物检验常用的显微镜，其构造分机械和光学两部分。机械部分主要包括：1镜筒 镜筒长度一般是160mm。它的上端装有接目镜，下端有回转板。回转板上一般装有3个接物镜。2载物台 载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔

2、。使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。3调节器 镜筒内旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒。调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。光学部分主要包括：1 接目镜 一般使用的显微镜具有23个接目镜，其上常刻有“5”、“l0”或“15”等数字及符号，意即使用时可放大5倍、l0倍或15倍。观察微生物时常用放大l0倍或15倍的接目镜。2接物镜 接物镜装在回转板上可分低倍镜、高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常是10、40(或45)l00(或90)。通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。例如，用放大40倍的接物镜(高倍

3、镜)与放大10倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为4010400，如果用放大15倍的接目镜则放大倍数为4015600。接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。油镜的放大倍数最大(90或100)。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短，直径就很小，所以自标本玻片透过的光线，因介质密度(从玻片至空气，再进入油镜)不同，有些光线因折射或全反射，就不能进入境头，致使射入的光线较少，物象显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片中间加入和玻璃折射率（n=1.52）相仿的镜油(香柏油， n=1.515)。因为这种接物镜使用

4、时须加镜油，所以我们称它为油镜(图82)。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油，所以也称干镜。使用低倍镜和高倍镜时，一般作活体的观察，不进行染色。在观察细小动物时，低倍镜主要用来区别动物的种类和看出它们的活动状态，而高倍镜则可看清动物的结构待征，低倍镜容易看到标本的全貌，油镜在大多数情况下是用来观察染色的涂片。3集光器 集光器在载物台的下面，用来集合由反光镜反射来的光线。集光器可以上下调整，中央装有光圈，用以调节光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。4反光镜 反光镜装在显微镜的最下方至集光器。(二)显微镜使用和保护的方法1低倍镜的使用法(1)置显微镜于固定的桌几上，窗外不宜有障碍

5、视线之物。(2)拨动回转板，把低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒连接而对直。(3)拨动反光镜向着光线的来源处。同时用眼对准接目镜(选用适当放大倍数的接目镜)仔细观察，使视野完全成为白色，这是光线已经通到镜里的表示。(4)把载玻片放到载物台上，要观察的标本放到圆孔的正中央。(5)将粗调节器向下旋转，同时眼睛注视接物镜，以防接物镜和载玻片相碰。当接目镜的尖端距载玻片约0.5cm时停止旋转。(6)把粗调节器向上旋转，同时左眼向接目镜里观察。如标本显出，但不十分清楚，可用细调节器调节，至标本完全清晰为止。(7)假如因旋转粗调节器太快，致使超过焦点，标本不能出现时，不应在眼睛注视接目镜的同时向下旋转粗调节器，

6、必须从第(5)步做起，以防因没有把握的旋转，使接目镜与载玻片碰触。(8)在观察时，最好两眼都能同时睁开一面看一面画出所看到的物象。2高倍镜的使用法(1)使用高倍镜以前，先用低倍镜检查，把要观察的标本放到视野正中。(2)拨动回转板使高倍和低倍两镜头互相对换。当高倍镜移动到载玻片时，往往镜头十分靠近载玻片。这时必须注意是否因高倍镜靠近的缘故而使载玻片也随着移动。如果载玻片有移动的现象，则应立刻停止推动回转板，把高倍镜退回原处，再按照使用低倍镜的方法，校正标本的位置，然后旋动调节器，使镜筒稍微向上，再对换高倍镜头。(3)当高倍镜已被推到镜筒下面时，向镜内观察所显现的标本，往往不很清楚，这时可旋转细调

7、节器，上下移动，但不要过分移动。3油镜的使用法(此节在实验三中学习)(1)如用高倍镜放大，倍数还不够，则须采用油镜。用油镜以前，先用高倍镜检查，把要观察的标本放到视野正中。(2)用油镜时，在载玻片上加一滴镜油，然后拨动回转板对换高倍镜和油镜，使油镜头尖端和油接触，而后向接目镜观察。假如不清晰，可稍微转动调节器，但切记不要用粗调节器。(3)用过油镜后，必须用擦镜纸或软绸将载玻片和油镜所粘着的油拭净。必要时，可略蘸二甲苯少许，揩拭镜头，最后用擦镜纸或软绸擦干。4显微镜的保护法(1)显微镜应放置在干燥的地方，使用时须避免强烈的日光照射。(2)接物镜或接目镜不清洁时，应当用擦镜纸或软绸揩擦。(3)用完

8、显微镜后，应当立即放到镜匣中。(三)显微镜观察(1)低倍镜观察1)在选定的接目镜下，利用低倍镜，确定目测微尺一格的长度(单位以m计)。2)观察教学生物标本玻片或所制备的微生物标本玻片，画出所见的形态草图。3)记下观察所用接目镜和接物镜的放大倍数和算出显微镜的放大倍数。(2)高倍镜观察1)改用高倍镜观察，画出微生物的形态草图，并与用低倍镜所看到的比较，注意其不同点。2)记下显微镜的放大倍数。四、记录序 号玻片名称放大倍数形态草图五、思考题1使用显微镜时，哪些地方须特别注意?2使用低倍镑时，显微镜的放大倍数一般最大可达多少?使用高倍镜时显微镜的放大倍数是怎样呢?在什么时候才需要使用油镜?实验二 微

9、型动物的计数一、目的显微镜观察活性污泥样品中微型动物的种类、数量及状态。二、实验器材1活性污泥法曝气池混合液。2显微镜、小量筒、滴管等。3计数板 如果没有微型动物计数的计数板(微型动物，即使是原生动物，也比细菌大得多，般的细菌或血球计数板都不适用)，则可按照上海织袜四厂和上海师范大学生物系所介绍的微型动物计数板制作方法制备如下：采用厚质玻璃割成9cm长，4cm宽的长方块，玻璃厚度以0.3一0.4cm为宜。利用氢氟酸腐蚀法，使玻板中央刻上10l0100个小方格，小方格的大小没有严格规定，只要一片大号盖玻片能盖满格子有余和便于在显微镜下计数就可以了。用大号盖玻片切成宽约0.7cm的玻条，用阿拉伯树

10、胶粘在计数用的小方格的四周，使呈一圈凸起的边框。这样，就制成了一块微型动物计数板，如图85所示。关于氢氟酸腐蚀法划方格的方法是先将玻璃表面涂一层薄面均匀的石蜡，然后用尖针在石蜡层上刻出所要求的方格，再以氢氟酸蒸汽进行重蒸。 三、计数方法及步骤 1将活性污泥法曝气池混合液轻轻搅拌均匀；如混合液较浓，则可稀释成1：1的液体(稀释方法：取l0mL量筒一个，加混合液5mL再加蒸馏水5mL，轻轻搅拌均匀，即成1：1稀释液)。 2取洗净的滴管一支(滴管每滴水的体积应预先标定，一般每一滴水的体积约为l20mL)，吸取摇匀的混合液或己稀释的混合液加一滴到计数板的中央方格内，然后加上一块洁净的大号盖玻片，使玻片

11、的四周正好搁在计数板四周凸起的边框上，侧视如图86所示。3用低倍显微镜进行计数 注意所滴加的液体不一定布满整个l00格小方格，在显微镜下计数时只要把充有液体的小方格，挨着次序一行行的计算即可。同时记录各种动物的活动能力、形态结构等。原生动物中有不少种类是群体，须将群体和群体上的个体分别计数。4计算 设在一滴水中测得钟虫30只，则每mL混合液中含有钟虫302201200只，如测得轮虫10只，则每毫升混合液含轮虫10220400只(如滴管每一摘体积为120mL，所观察的液体是1：l稀释的曝气池混合液)。四、记录微型动物优势种（数量及状态）描述：其他种（种类、数量及状态）描述：注：(1)如无计数板，

12、则可用下法进行计数：1)取洗净的滴管1支（其每一滴水的体积应预先标定）吸取混合均匀的曝气池混合液或已稀释的混合液，滴1滴在载玻片的中央，以盖玻片（以方形为好）轻轻盖上水滴，要避免盖玻片内形成气泡。2)将际本放在显微镜低倍镜下计数。计数时，先将视野放在盖玻片的右上角(可根据各人的习惯，也可放在另一用)，然后移动玻片，视野即可随之从上而下、从左而右通过。当前一个视野数完，并做好记录后，再换第二个视野，如此住复将整个盖玻片下面的动物全部计数完毕。注意在调换视野时，不可使相邦的视野重叠或遗漏。然后换算成1mL混合液中的动物数。3)生物滤池和生物转盘上的生物膜形成胶状，浓度大，一般都必须稀释后计数，其适

13、当的稀释比可在实践中摸索。4)上述计数方法仅适用于原生动物和轮虫，对个体较大的微型动物和线虫等，则须加大计数容量，以免造成误差。(2)为了避免微生物游动而影响计数，可用接种环加一环氯化汞（HgCl2）饱和溶液以杀死微生物。五、思考题怎样通过了解微型动物种类或数量变化来反映废水处理情况？实验三 大肠杆菌生长曲线的测定一、实验器材1培养基及大肠菌液(1)营养琼脂斜面培养基 可根据实验五中的配方，配置营养琼脂培养基后，再制成斜面。(2)肉膏蛋白胨液体培养基 配制方法同实验五中营养琼脂培养基，但不加琼脂。(3)浓肉膏蛋白胨液体培养基 配制方法同肉膏蛋白胨液体培养基，但浓度高5倍。(4)大肠杆菌培养液

14、将大肠杆菌接种于营养琼脂斜面培养基上，在37下培养18小时后，用无菌水加在斜面上，将菌洗下，作成一定浓度的细菌悬液，直接供实验接种用。或吸取0.3mL细菌悬液，接种到装有20mL肉膏蛋白胨液体培养基的大试管(20220mm)内，在37下，振荡培养18h。2吸管、烧杯等。3光电比色计、高压蒸汽灭菌器、电冰箱、振荡器或摇床等。二、实验内容1实验处理 以一定浓度的细菌悬液，分别等量地接种在12支液体培养基中，在培养后隔不同时间取出，放入冰箱保存。最后，用比浊法测定菌体生长情况。测量微生物生长的方法有多种。活菌数可用平板计数(菌落计数)法或稀释计数法。总菌数(包括活菌和死菌的个数)可在显微镜下直接计数

15、而求得，由于细菌悬液的浓度与其浑浊度成正比，因此也可利用光电比色计测定细菌悬液的光密度，从而推知菌液的浓度，本实验就是利用光电比色计进行量测（用平板计数法或稀释计数法可测出活菌数，从而得出不包括死菌的生长曲线。若教学时间和设备条件容许，宜采用平板计数法或稀释计数法）。为阐明生长曲线形成的原因，做3个实验处理：（1）正常生长曲线；（2）追加营养液处理；（3）加酸处理。 2实验步骤(1)接种 取12支装有灭菌过的肉膏蛋白胨液体培养基试管(每管装20mL培养基)，贴上标签(注明菌名、培养时间等)。然后，用1支1mL无菌吸管，每次准确地吸取0.2mL培养18h的大肠杆菌培养液，接种到肉膏蛋白胨液体培养

16、基内。接种后，轻轻摇荡，使菌体均匀分布。(2)培养 将接种后的12支液体培养基，置于振荡器或摇床上。37振荡培养。其中9支，分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h后取出，放冰箱中储存，最后一起比浊测定。 酸处理的1支试管，在培养4h后取出，加1mL无菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸3：1：1的体积比），然后继续振荡培养，在培养14h后取出，放入冰箱贮存。最后一起比浊测定。追加营养的两支试管，在培养6h后取出，各加入无菌浓肉膏蛋白胨液体培养基1mL，然后继续振荡培养，在培养8、14h后取出，放入冰箱贮存，最后一起比浊测定。(3) 比色、过比浊 把培养不同时间而形成不同浓度的细菌培养液

17、，置于分光光度计中进行比色。用光密度值的大小来代表细菌的生长量。以未接种的肉膏蛋白胨液体培养基为空白对照，在600 nm波长下测菌悬液的光密度值(OD600)。菌悬液的浓度与光密度值成正比，光密度值大者可以认为其生长情况较好。从最稀浓度的细菌悬液开始，依次测定。细菌悬液如果太浓，应适当稀释，使光密度降至0.00.4范围内。液体的浑浊度也可用浊度计测定。三、记录及报告要求1记录培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h之后细菌悬液的光密度值，以及4h加酸和6h追加营养液后，这三管菌液在所要求的培养时间时的光密度值。2以细菌悬液光密度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌正常、加酸和追加

18、营养的3条生长曲线，并加以比较，标出正常生长曲线中对数期的大致位置。四、思考题1常用的测定做生物生长的方法有哪几种?试略加讨论。2利用浑浊度所表示的细菌生长量是否包括死细菌?3你认为活性污泥的增长曲线应怎样测定才比较合适?实验四 细菌、霉菌、酵母菌、放线菌形态的观察一、目的1进一步掌握显微镜的使用方法。2观察几个典型细菌的形态(示范片)。3观察几个典型细菌的构造(示范片)。4观察霉菌、酵母菌、放线菌的形态和构造，以便找出它们之间及与细菌之间的区别点。二、实验器材1显微镜、擦镜纸、镜油（香柏油）、二甲苯等。2示范片(1)金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、四联球菌、尿八联球菌、链球菌、球衣细菌、大肠杆菌

19、、霍乱弧菌等。(2)枯草杆菌芽孢、假单胞杆菌鞭毛、固氮菌荚膜等。(3)酵母菌、霉菌、放线菌。三、实验内容和方法 1复习显微镜的使用方法，重点放在油镜的使用部分。 2严格按照显微镜的使用方法，依次逐个观察细菌的形态、构造及酵母菌、霉菌、放线菌的形态。分别绘出其形态、构造图。四、记录（细菌、霉菌、酵母菌、放线菌各一）序 号玻片名称放大倍数形态草图实验五 培养基的制备及灭菌 本次实验可为下次实验作准备。实验内容主要包括玻璃器皿的洗刷、包装和培养基的制备以及灭菌技术等。在进行微生物学实验时，所用培养基及玻璃器皿等均须进行灭菌。一、目的1学会玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。2掌握培养基配制和无菌水制备

20、的方法。3学会高压蒸汽灭菌技术。二、实验器材1培养皿(又称平皿，直径90mm)、试管、吸管、锥形瓶、烧杯等。2纱布、棉花、报纸、牛皮纸。3pH试纸68.4(或pH电位计或氢离子浓度比色计)、洗液、10HCL、10NaOH。4牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水。5高压蒸气灭菌器、烘箱、冰箱、电炉等。三、实验内容(一)玻璃器皿的洗刷与包装1洗刷 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。培养皿、试管、锥形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷，然后用自来水冲洗。吸管则先用洗液浸泡、再用水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿应放在烘箱中烘干。2包装(1)培养皿由一底一盖组成一套，按实验所需的套数一起用牛皮纸包装。(2)吸管应在吸端用

21、铁丝塞入少许棉花，构成1一1.5cm长的棉塞，以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的吸管的尖端，放在45cm宽的长纸条的一端，吸管与纸条约成45交角，折叠包装纸包住尖端(图88)，用左手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，纸条即螺旋式地包在管子外面，余下纸头折叠打结，按照实验需要，可单支包装或多支包装，以备灭菌。培养皿和吸管也有放在特制容器内进行灭菌的。(3)试管和锥形瓶等的管口或瓶口均需用棉花塞堵塞。做好的棉塞，四周应紧贴管壁和瓶口，不留缝隙，以防空气中微生物会沿棉塞皱折浸入。棉塞不宜过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为

22、准。棉塞的23应在管内或瓶口内，上端露出少许，以便拔塞。棉塞的大小及形状应如图89所示。在制作培养基的过程中，如不慎将棉塞沾上培养基时，应用清洁棉花重做。待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包裹，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内（用纸包裹是为了避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞)，以备灭菌。(二)培养基的制备1步骤(1)配制溶液 按培养基的配方，称取各种原料。取适量的烧杯盛所需水量，依次将各种原料加入、溶解。难溶的原料如蛋白陈、肉膏、琼脂等需加热溶解，这时，当原料全部溶解后应加水补充因蒸发损失的水量。加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。(2)调整pH值 用pH试纸(或pH电位计或氢离子浓度比色计)测定培养基溶

23、液的pH值。(3)过滤 用沙布、滤纸或棉花过滤均可。如培养基内杂质很少，可省略过滤。(4)分装 将培养基分装在试管和锥形瓶内。要使培养基直接流入管内或瓶内，注意防止沾污上段管壁或瓶壁，并避免浸湿棉塞。装入试管或锥形瓶的培养基量，视试管或瓶子的大小及需要而定。一般制备斜面培养基时，每支试管装入的量约为试管高度的1413。(5)斜面培养基的制作 将装含有琼脂的培养基的试管经灭菌后，趁热搁置在木条或木棒上，使试管呈适当的斜度(切勿倾斜过小，以免培养基沾污棉塞)。待培养基凝固后，即成斜面(图73)。2营养琼脂培养基(肉膏、蛋白陈、琼脂培养基)营养琼脂培养基是一种固体培养基，本实验制备后可供活性污泥纯种

24、分离和细菌总数测定之用。(1)成分蛋白陈 2.5g牛肉膏 0.75g氯化钠 1.25g琼脂 2.55g蒸馏水 250mL(2)制法1)将上列成分混合后，煮沸至琼脂完全溶解。2)用蒸馏水补充因蒸发而损失的水量。3)调整溶液的pH值为7.47.6。4)乘热用纱布或脱脂棉过滤(最好用保温漏斗)，并分装于试管中，每管约装1015mL。如装在锥形瓶中，则250mL的锥形瓶，以装100mL左右为宜。管口或瓶口均以棉花塞住。5)置高压蒸汽灭菌器中，以121(1kgcm2)灭菌20min，然后贮存于冷暗处备用。(三)无菌水的制备在试管或瓶内先盛以适量的自来水(不用蒸馏水，管口或瓶口用塞子塞好，并用牛皮纸扎紧)

25、，使其灭菌后，其水量恰为9mL(用管)或99mL(用瓶)。此种适量的水体积可在灭菌器内由实验求得。也可以先将管或瓶灭菌，再用灭菌的吸管(所谓无菌吸管)取灭菌的自来水9mL或99mL加入管或瓶中。无菌水常用来稀释水样。(四)高压蒸汽灭菌上面所准备好的一切玻璃器皿、培养基等均需进行灭菌。本实验用高压蒸汽灭菌器灭菌，其操作和注意事项如下：1加水 热源为煤气灯或电炉者，需先加水至器内底层隔板以下13处。有加水口的，水由加水口加入，由玻璃管看水位至止水线即停止加水。若热源为蒸汽，则不必加水。2把需要灭菌的器物放入灭菌器内，关严灭菌器盖，勿使漏气。3打开出气口。4点火。如热源为蒸汽，则应慢慢打开蒸汽进口，

26、不要让蒸汽过猛地冲入灭菌器内。5器内水沸腾以后，蒸汽逐渐驱除器内原有的冷空气。如灭菌器装有温度计，当指针指到读数100时，证明器内已经充满蒸汽、可以关闭出气口。如没有温度计，则当出气口排出的蒸汽相当猛烈时，可以认为灭菌器内冷空气已经全部被蒸汽驱尽，可以关闭出气口。这一点应持别注意，因为如果冷空气没有排尽，器内虽然达到了一定的压力，但并不会达到相应所需的温度。6关闭出气口后，器内蒸汽将不断增多，压力和温度随着升高。当蒸汽压达到所需的压力时，即为灭菌开始时间，这时要调节火力大小，以维持所需的压力。灭菌时间的长短由灭菌物品决定。玻璃器皿、无菌水、营养琼脂培养基可用1kgcm2 (121)的压力灭菌2

27、0min，合糖的培养基用0.7kgcm2(115)的压力20min。7灭菌时间到达后，停止加热。8待压力指针降到“0”时，打开出气口。如过早打开，管内和瓶内的培养基会因压力骤降，而温度并不同时很快下降，以致培养基翻腾，沾污锦塞。9揭开器盖，取出灭菌的物品，将器内剩余的水放掉。10待已灭菌的物品冷却后，置阴凉处。本实验，除学习培养基制备和高压灭菌法外，还要为下次实验作好难备。所以所用培养皿、吸管、试管、锥形瓶、烧杯等玻璃器皿以及无菌水、培养基等的量均须根据下次实验所需准备。四、思考题1培养基是根据什么原理配制的?营养琼脂培养基中的成分各起什么作用?2为什么湿热灭菌比干热灭菌优越?实验六 微生物的

28、染色一、目的学习微生物涂片染色的操作技术、掌握微生物的革兰氏染色法。二、实验器材1菌种(由实验室提供)。2显微镜、载玻片、接种环、酒精灯等。3染料革兰氏染色剂1)草酸铵结晶紫染色液甲液 结晶紫 2.5g 95酒精 25mL乙液 草酸铵 1g 蒸馏水 100mL混合甲、乙两液即成。2)碘液碘 1g碘化钾 2g蒸馏水 300mL先将碘化钾溶解在一小部分水中，再将碘溶解在碘化钾溶液中，然后加入其余的水即成。3)沙黄染色液沙黄(蕃红) 2.5g95酒精 100ml取上述配好的沙黄酒精溶液10mL与90mL蒸溜水混匀，即成沙黄稀释液，作革兰氏染色用。三、操作方法及步骤革兰氏染色1将实验所供菌种按单染色法

29、作涂片、干燥并固定。2在涂面上，加草酸铵结晶紫染色液一滴约1min后，水洗。3加碘液1min后，水洗。4斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95酒精脱色，并轻轻摇动玻片，至流出的酒精不现紫色时立即停止滴加(约滴加0.51min)，随即水洗。为了节约酒精，也可将酒精滴至涂片上，静置0.51min后水洗。酒精脱色程度必须严加掌握。如脱色过度，则阳性菌会被误染为阴性菌，而脱色不够时，阴性菌将被误染为阳性菌。5加沙黄复染液0.5min，水洗。6吸干，置于油镜下观察，阳性者为紫色，阴性者为红色。四、思考题1微生物的染色原理是什么?2你用革兰氏染色法染色后看到的细菌是什么颜色，属于革兰氏阴性还是阳性?革兰氏染色法

30、在微生物学中有何重要意义?3革兰氏染色法中若只做14的步骤而不用沙黄复染液复染，是否能分出革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，为什么?4微生物经固定后，是死了呢还是仍活着?实验七 微生物纯种分离、培养及接种技术本实验的对象是水样或活性污泥中微生物的纯种分离和培养。通常，在处理不同水质的废水时，起作用的微生物群和种类也不同。我们除可用显微镜直接观察微生物形态，大致了解其中的微生物种群外，更重要的还必须研究是哪些种类的微生物对该种废水起生物氧化作用，其作用原理是什么，产生什么产物等等，以便提高处理效果。此外，有时我们还需从土壤环境中分离和培养纯菌种来处理工业废水。因此，为了从事以上这些研究工作，就必须学习

31、微生物纯种分离、培养及接种的技术，进而再学会做微生物生理生化反应的实验，为废水处理服务。在给水处理的细菌检查中，细菌的分离、培养和接种也是一个重要环节。微生物纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。在本实验中仍要学习这两种方法。一、目的要求 掌握几种常用的分离纯化物的基本操作技术。二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：1选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物； 2微生物

32、在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等计数来完成的。纯培养的确定：1确定其菌落观察特征；2结合显微镜检测个体形态特征的确定。三、实验器材1无菌培养皿(直径90mm)、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌试管、5管无菌水(每管有9mL灭菌过的自来水)。2营养琼脂培养基(已灭菌的) 、水样或活性污泥。3接种环、酒精好(或煤气灯)、恒温箱(培养箱)等。以上器材，除水样或活性污泥、接种环、恒温箱外，均在实验五中准备好。四、操作方法及步骤(一)活性污泥的纯种分离与培养1稀释平板分离(1)取样(2)稀释水样

33、1)将5支装有9mL无菌水的试管以0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001（或101、102、103、104、105）依次编号。2)以无菌操作，用1mL的无菌吸管吸取1mL样品于第一管无菌水中，将吸管吸洗3次，摇匀，即为稀释10倍的菌液。再从此0.1浓度的菌液中吸取1mL于第二管中，将吸管吸洗3次，摇匀，即为稀释100倍的菌液，以同样方法，依次类推，分别得到稀释103倍、104倍及105倍的菌液，所得菌液分别为0.1、0.01、0.001、0.0001及0.00001(即101、102、103、104及105)等浓度。(3)平板的制作I)将无菌培养皿编号为0.1、0.01、0

34、.00001(101、102、105)。2)另取一支lmL的无菌吸管从浓度小的105的菌液开始，依次分别取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内(每个浓度做3个平板)。每次吸取时，吸管都应在菌液中反复吸洗几次。3)在稀释菌液的同时，就要将营养琼脂培养基加热融化，待融化的培养基冷到40一50C左右(温度不可过高，否则微生物容易被烫死，温度过低，培养基容易凝固，平板不平)时，倾注10一15mL入上述盛有菌液的培养皿内(每一培养皿内应加入的培养基量须根据皿的大小决定，以能使培养皿底部铺满培养基而形成厚约23mm的薄层为适当，在直径为90mm的培养皿内注入1015mL，可满足此要求)，如图72所示。在倾注

35、前，应先将盛有培养基的管子的管口或瓶子的瓶口在火焰上微烧一周。培养基倾入后迅速盖上皿盖，培养基倾入后平放桌上，轻轻转动，使培养基和稀释菌液充分混合均匀，冷却后，即成平板。将培养皿倒置于30C的恒温箱中培养24h，观察有无菌落长出。培养皿所以要倒置是为了防止培养基内水分蒸发到皿盖上而使培养基变干。2平板划线分离。(1)取样 同前。(2)制备平板培养基 将融化的营养琼脂培养基以无菌操作倒入无菌的空培养皿内(操作方法同前，但培养皿内末注入菌液)。加盖，在平桌上转动，凝固后即成所需的平板。(3)划线 以无菌操作，右手持经烧灼灭菌冷却的接种环从装有活性污泥的器皿中取一环活性污泥。同时左手持培养皿，以中指

36、、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀起一些，右手把接种环伸入培养皿，将一环活性污泥在平板表面轻轻地划线(千万不要戳破培养基平板)，可作平行划线、扇形划线，或其它连续划线。无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。划线后，将皿盖盖好。倒置培养皿于30C恒温箱内培养24h，则平板上即长出菌落。接种环用过后即再烧灼灭菌。(二)其它一些接种的操作技术微生物的接种方法，除前面所提到的外，随着所用的培养基、实验目的等的不同，还有好几种，但是它们的基本操作都是类似的，并且都要严格注意无菌操作。1斜面接种技术 这是将微生物从一个斜面培养基

37、(或平板培养基)上接种到另一个斜面培养基上的方法，见图810。斜面培养基可用小试管(15mm150mm)制备，每管约装3一5mL(14一13试管高度)，见图73。(1)将试管贴上标签、注明菌名、接种日期等。(2)将培养好的菌种和斜面培养基的两支试管用大拇指和其它4指握在左手中，使中指位于两试管之间的部分。斜面向上，管口齐平，并使它们位于水平位置。(3)将棉塞用右手拧转松动，以利接种时拔出。(4)右手拿接种环，在火焰上将环烧灼灭菌，环上凡是在接种时可能进入试管的部分都应用火烧灼。(5)在火焰旁，用右手拔掉棉塞。(6)以火焰微烧试管口一周，烧灼时应不断地转动管口，使管口上可能沾污的少量菌或带菌尘埃

38、得以烧去。(7)将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触没有长菌的培养基部分(如斜面的顶端)，使其冷却，以免烫死被接种的菌种。然后轻轻挑取少许菌种，抽出接种环并迅速将接种环伸进另一试管，在培养基上轻轻划线(由底部向顶部划线)。(8)接种完后，将接种环取出，将试管塞好棉塞。2液体接种 这是由斜面培养基(或平板培养基)接种到液体培养基中的方法。(1)操作方法与前同，试管可略向上斜，以免培养基流出。(2)将取有菌种的接种环送入液体培养基时，可使环在液体表面与管壁接触的部分轻轻摩擦，接种后，塞上棉塞。将试管在手掌内轻轻转动，使菌体在培养基中均匀分散。3由液体培养基接种液体培养基 接种用具常用无菌吸管或无

39、菌滴管。无菌操作注意事项与前同，吸管或滴管要预先经干热或湿热法灭菌，不能在火焰上烧灼。具体操作较简单，只要用无菌吸管或滴管从有菌的试管吸取一定量的培养液到另一管液体培养基中，塞好棉塞即可。4穿刺接种 这是由斜面菌种接种到固体深层培养基的方法。培养基可装于大试管(20mm220mm)内，每管约装1215mL。(1)如前斜面接种操作，但用接种针(必须很挺直)取出少许菌种。(2)用左手斜握盛有固体深层培养基的试管，用右手将接种针移入培养基，自中心刺入，直到接近管底，但不要穿透。然后沿穿刺途径缓慢将针拔出。这样，接种线整齐，易于观察。将以上分离、接种的培养物置于恒温箱中在一定温度下培养一定时间后观察结

40、果。接种环和接种针用毕后均应再烧灼灭菌。微生物的分离、培养、接种等操作，前已述及，最好在经紫外线灭菌的无菌室内或无菌箱内进行，要严格注意无菌操作。在没有无菌室或无菌箱的情况下，实验精度又要求不高时，则可在一般的实验室内进行，但必须特别注意无菌操作。五、思考题用一根无菌吸管取几种浓度的水样时，应从哪一个浓度开始?为什么?实验八 纯培养菌种的菌体、菌落形态观察本实验是将实验七中分离出来的几种微生物为材料，进行菌体形态、菌落形态特征的观察。并通过革兰氏染色，以了解活性污泥中大体由哪些类群的微生物所组成。一、实验器材1显微镜、载玻片、接种环、酒精灯。2革兰氏染色液全套。3实验七培养出来的各种菌种。二、

41、实验内容和方法1接种斜面培养基 将已经分离培养出来的几种不同形态特征的菌落在无菌操作条件下，用接种环分别挑取少许菌种接种到各个斜面培养基上，塞好棉塞，放在试管架上，置于30恒温箱中培养36h后，进行观察。2菌落形态特征的观察 由于微生物个体的表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性以及产生色素的能力等各不相同，因而个体在固体培养基上的情况各有特点。按照微生物在固体培养基上形成的菌落的特征，可粗略地辨别是何种类型的微生物。应注意菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、透明度、气味及粘滞性等。一般来说，细菌和酵母菌的菌落比较光滑湿润，用接种环容易将菌体挑起。放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与基质紧

42、密结合，不易被针或环挑起。霉菌菌落常长成绒状或棉絮状。如果要鉴定菌种，则对微生物在斜面培养基上及液体培养基中生长的特征都应比较详细地观察。在斜面培养基上观察菌落生长旺盛程度、形状、颜色及光泽等。在液体培养基中则观察浑浊度、有无沉淀、液体表面生膜与否、膜的形状等。在穿刺接种时则观察菌落在基质表面的情况、菌落的延伸情况以及是否液化培养基和液化的情况等。观察时绘出菌落形态特征图。本实验只学习观察一般微生物菌落形态待征，不作菌种鉴定。所以，只做琼脂平板和琼脂斜面的观察，并同时结合微生物个体形态观察，以达到了解和熟悉几种微生物的菌落形态和个体形态持征。3微生物个体形态观察 在观察了已培养好的各种微生物菌

43、落形态以后，用革兰氏染色法染色，进行显微镜油镜的观察，并绘制形态图。三、记录1、菌落形态特征的观察菌落序号形态边缘菌落直径菌落高度颜色透明度气味粘滞性2、微生物个体形态观察序 号玻片名称放大倍数形态草图三、思考题你从样品中分离出几种微生物?其菌落形态和个体形态是怎样的?革兰氏染色呈什么反应。实验九 微生物的生理生化特性微生物的代谢与呼吸，主要依赖于酶的活动。各种微生物具有不同的酶类，因此，它们对某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情况不同，代谢产物也有所不同。所以，我们可以利用各种微生物生理生化反应的特点来作为鉴别它们的一种依据。本实验以大肠菌群为例子。一、实验目的在水处理工程中，水源水要经过

44、处理后才能供给用户。饮用水要求清澈、无色、无臭，更重要的是没有病原菌。因此，自来水在出厂以前要作水质的物理化学分析和细菌检验，本实验结合给水净化工程中的细菌检验，作细菌总数和大肠菌群的测定。通过大肠菌群的测定，了解大肠杆菌的生理生化特性。大肠菌群数系指每升水样中所含有的大肠菌群的数目。大肠菌数一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸椽酸盐杆菌和副大肠杆菌。本实验的发酵试验采用含有乳糖的培养基，故测定结果不包括副大肠杆菌。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37C经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数(实际上所表示的是腐生细菌的数目。腐生细菌在营养琼脂培养基上所形成的菌落呈白色细点状)。我国

45、现行生活饮用水卫生标准GB574985规定：细菌总数是指1mL水中不得超过100个，大肠菌群1L水中不得超过3个。二、实验用具1水样瓶 任何具有玻璃塞、质量良好的玻璃瓶都可用。2吸管、试管、锥形瓶等。3稀释瓶 稀释水样所用的玻璃瓶最好为瘦长形，并具有严密的玻璃塞，其容量要比实际用的水量大二倍，有时可在普通试管上加塞，作为稀释管。瓶口或管端须以纸或纱布包好扎紧。4培养皿(平皿) 般采用直径90mm，高15mm的。5发酵管和发酵瓶(图811) 发酵管有大小之别，小发酵管可用15mm150mm的试管，大发酵管和发酵瓶须有200mL以上的容量。管和瓶内都须装倒置的小试管(直径一般510mm、长20一40mm，小发酵管取用较小的小试管，大发酵管和发酵瓶取用较大的小试管