干细胞和细胞治疗.ppt
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1、1,干细胞和细胞治疗 stem cell and cell therapy,2,干细胞stem cell,未分化细胞自我更新(self-renew)无限增殖 体外长期培养多向分化潜能(multipotential),3,4,干细胞的类型:,胚胎干细胞 embryonic stem cells 胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞,有自我更新和多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。成体干细胞 adult stem cells 成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞,包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞,因此又称为组织干细胞。如神经干细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、上皮干细胞
2、、肝干细胞、胰腺干细胞等。,5,胚胎干细胞embryonic stem cells(ES细胞),6,胚胎早期发生:囊胚形成(囊胚内细胞团),7,排卵、早期胚胎发生(囊胚形成),8,胚胎干细胞的分离和建系,将囊胚内细胞团的细胞通过体外培养产生未分化的细胞克隆,建立胚胎干细胞系1981年Evans 和 Martin 首次成功分离和建立小鼠胚胎干细胞系1998年Thomson 等首次成功分离和建立人胚胎干细胞系 胚胎干细胞可在体外诱导分化形成各种成体细胞,9,胚胎干细胞体外诱导分化,外源诱导因子诱导ES细胞分化 诱导因子:维甲酸(RA)、骨形成蛋白BMPs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)等转基因诱
3、导ES细胞分化 用转基因技术使某种促分化基因在ES细胞中表达、调节其分化与其他细胞共培养诱导ES细胞分化 创造细胞分化的微环境,10,胚胎干细胞体外诱导分化,11,成体干细胞adult stem cells又称组织干细胞tissue stem cells,12,成体干细胞的概念,成体干细胞又称组织干细胞,传统的观念认为它们是存在于成体组织的未分化细胞,现在认为也包括未成年动物的组织干细胞,它们具有不断增殖和自我更新能力、又具有多向分化潜能。如造血干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、上皮干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞等,13,成体干细胞的功能,自然条件下成体干细胞倾向于分化成所在组织的
4、细胞,参与组织更新和损伤修复;外界条件诱导下成体干细胞可横向分化成其他组织的细胞,参与这些组织的损伤修复。,14,造血干细胞的分化,15,表皮干细胞的分化,16,干细胞应用前景,细胞治疗 组织工程 药物筛选 发育研究 基因功能研究,17,细胞治疗cell therapy,细胞治疗是指将正常或遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内,以达到替代受损细胞、治疗疾病的目的。利用干细胞及其分化细胞进行细胞治疗是干细胞临床应用的重要研究方向。胚胎干细胞和成体干细胞都能用于细胞治疗,但目前只有少数成体干细胞在细胞治疗上己开始取得临床疗效,大多数的干细胞治疗还在实验阶段。,18,血液病的细胞治疗,如白血病
5、的细胞治疗 造血干细胞移植:自体移植(脐带血造血干细胞)无排斥反应 同系移植(同卵孪生之间骨髓 造血干细胞)一般无排斥反应 同种移植(人与人之间骨髓造血干细胞)有排斥反应(供、受者组织相容性抗原不同)需组织配型、选择供者(骨髓库);抑制受者的免疫应答、诱导免疫耐受。,19,神经系统疾病的细胞治疗,如帕金森氏病细胞治疗胚胎干细胞细胞移植神经干细胞细胞移植 1、干细胞直接移植 2、诱导分化成相应神经细胞(多巴胺能神经元)后进行细胞移植,20,心肌疾病的细胞治疗,如心肌梗塞的细胞治疗 胚胎干细胞 诱导分化成心肌细胞 细胞移植 成体干细胞(骨髓基质干细胞、脂肪干细胞、心肌干细胞等)诱导分化成心肌细胞
6、细胞移植,21,干细胞治疗中的难点,异体移植的免疫排斥反应 解决途径:自身体细胞核移植(治疗性克隆)干细胞基因改造 采用自身干细胞成瘤性的危险 胚胎干细胞植入动物体内会形成畸胎瘤,如何防止干细胞移植后可能因分化不彻底形成肿瘤,是必须解决的问题。解决途径:完善定向诱导分化方法 改进筛选纯化技术,22,治疗性克隆(体细胞核移植),23,我们实验室的一项工作,胰腺干细胞的 细胞分化与I 型糖尿病的干细胞治疗,24,I 型糖尿病的治疗,外源胰岛素治疗胰腺或胰岛移植干细胞治疗:胚胎干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植 基因导入使其表达胰岛素 细胞移植胰腺干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植,25,胰腺干细胞
7、的标志 1990年,Lendahl 等人发现神经干细胞中存在一种新的中间丝蛋白巢蛋白(nestin),现在 nestin已是公认的神经干细胞标志之一。2000年,Hunziker 和 Stein 发现胰腺导管和胰岛中也存在 nestin阳性细胞。2001年,Zulewski等人从胰腺中分离到nestin阳性细胞,将其命名为NIPs(nestin-positive islet-derived progenitor cells),并发现具有多向分化潜能(multipotential),在体外可自发形成类胰岛细胞团(islet-like cell clusters,ICCs).因此,人们相信nest
8、in可能也是胰腺干细胞的标志。但是,NIPs是否确实是胰腺干细胞,能否用于细胞治疗必须进一步证实。2001年起,我们为此做了一点实验。,26,我们的实验:,人胎胰腺 nestin阳性细胞的分离、体外培养和生物学特性检测(目的是确认 NIPs是胰腺干细胞);体外诱导分化 NIPs形成能产生胰岛素的细胞;类胰岛细胞团(ICCs)异种体内移植 糖尿病的干细胞治疗实验研究。,27,第一个实验:,人胎胰腺 nestin阳性细胞(NIPs)的分离、体外培养和生物学特性检测,28,人胎胰腺的 nestin 阳性细胞的分布免疫组化技术显示nestin阳性细胞,nestin 阳性细胞位于胰腺小导管壁及其相连的原
9、始细胞团,分离胎胰导管和细胞团 在EHAA培养液(含2%FBS)中进行原代培养,在 EHAA 培养液中的胎胰导管和细胞团,培养48小时后细胞贴壁并开始铺开,贴壁细胞鉴别:是否存在NIPs免疫荧光染色检测CK19、胰岛素、nestin 阳性细胞,呈CK19 阳性的胰腺上皮细胞(细胞较大),呈胰岛素阳性的 细胞(细胞较小),nestin阳性细胞(NIPs)(梭形),31,NIPs的筛选培养和体外扩增贴壁细胞在无糖低血清条件培养液中筛选培养NIPs4周后大部分细胞死亡、仅存少量梭形细胞(NIPs),DMEM/F12培养液中加生长因子bFGF促进梭形细胞(NIPs)体外扩增。亚克隆纯化、传代培养图为由
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