2015年修改版维生素的测定.ppt

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1、4.7 维生素的测定,概述脂溶性维生素A、E的测定水溶性维生素 B、C的测定,4.7.1 概述,（1）维生素的分类及生理功能（2）测定的目的和意义（3）维生素的测定方法,（1）维生素的分类及生理功能,功能：维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物，结构复杂，种类多。目前已经确认的有30多种，其中有20种被认为与维持人体健康和促进生长发育是至关重要的。主要是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，人体对它的需要量极少，但作用非常大。一般在体内不能合成或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相关新陈代谢的紊乱，出现各种特有的症状。,分类：按溶解性能可将

2、它们分成两大类：一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的，叫脂溶性维生素（如A、D、E、K等）；另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。,（2）测定的目的和意义,可评价食品的营养价值；开发利用富含维生素的食品；多数维生素的性质不稳定，常常作为强化剂在食品工业的某些产品中使用。可以研究食品在不同的加工、储存条件下的稳定性，进而指导人们制定合理的工艺条件，减少维生素的损失；起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒。,（3）维生素的测定方法微生物法：基于某种微生物生长需要特定的维生素，方法特异性强、灵敏度高、不需要特殊仪器，样品不需经特殊处理，但只能测

3、定水溶性维生素。化学法：比色法、滴定法仪器法：色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。特别是HPLC可用于大多数维生素的测定，并且在某些条件下可同时分析几种维生素，但分析费用较高。应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析方法,重点讲解的方法：高效液相色谱法（HPLC法）同时测定脂溶性维生素A和维生素E比色法测定维生素AHPLC法测定胡萝卜素滴定法和比色法测定维生素C荧光法测定 B1、B2,4.7.2 维生素A、E的测定HPLC法（GB/T 5009.82),以乳粉为样品演示样品的预处理和HPLC的使用VA的性质：维生素A是-紫罗酮环与一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称。通常所说的维生素A是指视黄

4、醇或视黄醇醋酸酯。因有许多不饱和链，故见光易分解；在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。测定速度要快。不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定,VE的性质：又称生育酚，目前已经确认 的有8种异构体，最常见的有、-生育酚。溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱性环境中稳定，无氧条件下，对热、光及碱性环境中也相对稳定。VE广泛分布在各种粮食的胚和植物油中。,测定原理：（1）液相色谱的原理：液相色谱是采用液体为流动相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录和数据处理装置等部分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容器吸取作为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由进样装置导入，随流动相在色

5、谱柱内进行分离。分离后的组分进入检测器检测，并用记录仪绘出色谱图，或与其他数据处理装置相连，由数据处理系统进行数据处理 色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点作图。,（2）高效液相色谱检测样品中的维生素A、E的原理：样品中的维生素E及维生素A经皂化提取处理后，将其从不皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生E和维生素A分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量,(3）什么是内标法？取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱，根据色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面

6、积或峰高的比例为纵坐标，取标准被测成分量和内标物质量之比或标准被测成分量为横坐标，制成标准曲线。然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试样液时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，然后按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高之比，再按标准曲线来求出被测成分的含量。,内标物的选取原则：能与被测成分完全分离，但其保留时间又尽可能接近被测成分的稳定的物质。,试剂（1）无水乙醚：不含有过氧化物。（2）无水乙醇：不得含有醛类物质。（3）无水硫酸钠。（4）甲醇：重蒸后使用。（5）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。（6）抗坏血酸溶液（100gL）：

7、临用前进行配制。（7）氢氧化钾溶液（50g100g）：取50g氢氧化钾,溶于50g水中，混匀,标准溶液的配制（1）维生素 A标准液：视黄醇（纯度85）或视黄醇乙酸酯（纯度90）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为lmg/mL。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。（2）维生素E标准液：a-生育酚（纯度95），-生育酚（纯纯95），-生育酚（纯度95）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为lmg/mL,临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。（3）内标溶液：称取苯并芘（纯度98），用脱醛乙醇配制成10ug/mL 的内标溶液。,仪器和设

8、备（1）高效液相色谱仪带紫外分光检测器。（2）旋转蒸发器。（3）高速离心机（带小塑料离心管）（4）高纯氮气。（5）紫外分光光度计。,样品处理：皂化提取洗涤浓缩 定容,（1）皂化：称取适量样品于三角瓶中，加30mL无水乙醇，振摇使样品分散。加入 5mL100g/L抗坏血酸溶液和 2.0mL苯并芘内标液，混匀，加 10mL氢氧化钾溶液，沸水回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。思考：皂化时加入Vc的作用是什么？,（2）提取：将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2-3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL无水乙醚分2次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇2mi

9、n，静置分层，弃去水层。,(3)洗涤：每次用约50mL水将乙醚液洗至中性，需洗45次,（4）浓缩：将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g）滤入150 mL旋转蒸发瓶内，用约15mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，于55水浴中减压蒸馏并回收乙醚，醚剩下约2mL时，取下蒸发瓶。,（5）定容：用氮气吹干乙醚，随即加入2mL乙醇，充分混合，溶解提取物。5000r/min离心5min，上清液供色谱分析用。,液相色谱推荐条件：分析柱：C18反相柱 5m，4.6mm25Cm；流动相：甲醇：水=98：2，混匀，临用前脱气；紫外检测器波长：300nm;进样量：20 L；流速：1.70mL/min。,标

10、准曲线的制备（1）维生素A和维生素E标准溶液的标定：取上述配制的维生素A、E的标准溶液按一定的倍数进行稀释，在下表要求的条件下测定其吸光度，根据其吸光系数计算其准确浓度。,标准溶液浓度计算：p-某维生素浓度，mg/mL；A-维生素的平均紫外吸光值；E-某种维生素l比吸光系数;F-稀释倍数。,（2）标准曲线的制备:本方法采用内标法定量。把高、低两个浓度的 维生素A、-生育酚、a-生育酚、-生育酚及内标苯并芘液混合，（其内标苯并芘的浓度值相同）将二种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图。以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素的浓度(ug/mL）为横坐标绘制标准曲线。,样品分析：取样品

11、处理液20 l，用标准溶液同样的条件进行色谱分析，绘制色谱图。定性：根据保留时间定性定量：根据色谱图求出某种维生素的峰面积与内标物峰面积的比值，以此比值在标准曲线上查得待测维生素的含量。,计算：式中：X-某种维生素的含量，mg/100g；P-由标准曲线上查到的某种维生素含量，g/mL；V-样品浓缩后定容体积，ml；m-样品质量，g。,说明及讨论（1）维生素极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或使用棕色玻璃仪器。（2）乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。（3）本法是国家标准检验方法，适用于各种食物和饲料中维生素A和维生素E的

12、同时测定。（4）本法不能将-生育酚-生育酚分开，所以-生育酚的色谱峰中含有-生育酚。,IU（国际单位）与质量的换算,1IUVa=0.33g1IU-胡萝卜素=0.6g1Ug Vd=40IU 1IUVd=0.025g1IU维生素D=0.025ug维生素D31IU Ve=1mg Ve(DL-a-生育酚醋酸酯)1mgDL-a-生育酚=1.1IU Ve1mgD-a-生育酚=1.49 IU Ve1mgD-a-生育酚醋酸酯=1.36 IU Ve,4.7.3 维生素A的测定（三氯化锑比色法）原理：VA+三氯化锑蓝色物质，于620nm测吸光度，与标准比较定量。试剂：无水Na2SO4、乙酸酐：吸水 乙醚：抽提 乙

13、醇、KOH：皂化反应 三氯甲烷：溶剂 三氯化锑-三氯甲烷：反应试剂 酚酞：用于鉴别洗涤液中有无碱,步骤：（1）预处理：皂化、提取、洗涤、浓缩（2）制备标准曲线：用VA标准液绘制，用CHCl3调零。注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6秒内测定(3)样品测定：用样品溶液代替标准液溶液。,说明(1)萃取时,不要用力过猛，避免发生乳化。（2）氯仿中必须无水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。（3）由于三氯化锑与VA所产生的兰色物质不稳定，注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6秒内测定。（4）三氯化锑腐蚀性强，且遇水生成白色沉淀，实验用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。,植物油中VE的测定（文献

14、方法）,样品处理：准确称取1g左右的样品用25mL丙酮溶解。仪器条件：流动相：乙腈+甲醇=80+20 流速：1.2ml/min 色谱柱：C18反相柱 波长：298nm 此法可以同时测定-生育酚、a-生育酚、-生育酚,4.7.4-胡萝卜素的测定（HPLC法）,试样中的-胡萝卜素，用石油醚+丙酮混合液提取，经三氧化铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，以峰高或峰面积定量。注意：浓缩提取液时，防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。,4.7.5 维生素B1的测定荧光法(GB/T 5009.84),原理：硫胺素（VB1）在碱性铁氰化钾溶液中被氧化为嘧噻色素，在紫外线

15、照射下，嘧噻色素发出荧光。在给定条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，荧光强度与嘧噻色素成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。试样在硫酸作用下，加热提取VB1，冷却后用淀粉酶处理使VB1分离，然后以所得溶液做测定。测定步骤：提取(水解、酶解）净化氧化测定水解、酶解的作用:使结合态VB1变为游离态VB1,维生素B1的测定HPLC法,维生素B1通常采用反相键合相色谱法进行分离，利用紫外检测器或荧光检测器进行测定。利用荧光检测器检测时，应首先使从样品中提取的维生素B1氧化成硫色素，然后转入正丁醇或异丁醇中，再进行HPLC分析。,4.7.6 维生素B2的测定荧光法,原理：试样在稀盐酸中水解、酶解，调整 PH

16、值，过滤除去蛋白质等物质；试样溶液经高锰酸钾氧化，除去干扰物，再经硅镁吸附剂的柱层析，提纯的核黄素在波长525nm下发生黄绿色荧光，在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。再加入低亚硫酸钠，将VB2还原成无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光，两者相差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。测定核黄素的方法还有：微生物法和HPLC法。,4.7.7 维生素C（抗坏血酸）的测定,维生素C的生理功能及性质维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生

17、理作用。在食品中，这三种形式均有存在，但主要是前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。,还原型维生素 C有强还原性，有抑制多酚氧化酶作用，故常添加于啤酒、果汁等食品中作抗氧化剂。在新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。,维生素C 的测定方法2，6二氯靛酚滴定法2，4二硝基苯肼比色法荧光法高效液相色谱法,（1）2，6二氯靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸的含量 该方法简便、灵敏，但特异性差，样品中的其他还原性物质（如铁离子、铜离子等）会干扰测定，使结果偏高，对色深样液的滴定终点不易辨别。,（2）2，4二硝基苯肼比色法和荧光法测得的是抗坏

18、血酸和脱氢抗坏血酸的总量。苯肼法操作复杂，特异性差，易受共存物质的影响；荧光法受干扰的影响较小，结果较准确，重现性好，但操作复杂。,（3）高效液相色谱法可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量。具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速等优点，是上述几种方法中最先进、可靠的方法。但分析成本较高。主要介绍维生素C常用的测定方法2，6二氯靛酚滴定法、苯肼比色法,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,以新鲜果蔬为样品进行讲解和演示原理：还原型抗坏血酸可以还原染料2，6二氯靛酚。该染料在酸性溶液中是粉红色（在中性或碱性溶液中呈蓝色），被还原后颜色消失；还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。

19、在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。,试剂 1%草酸溶液 2%草酸溶液 抗坏血酸标准溶液 2，6二氯靛酚溶液 0.001mol/L碘酸钾标准溶液:精确称取干燥的碘酸钾0.3567g，用水稀释至100ml，取出1ml，用水稀至100ml，此溶液1ml相当于抗坏血酸0.088mg。1%淀粉溶液 6%碘化钾溶液,抗坏血酸标准溶液的配制及标定：配制：准确称取20mg抗坏血酸，溶于1的草酸中，并稀释至100ml，置冰箱中保存。用时取出5ml，置于50ml容量瓶中，用1草酸溶液定容，配成0.02mg/ml的抗坏血酸标准溶液。标定：吸取标准使用液 5ml于三角

20、瓶中，加入 6碘化钾溶液0.5ml、1淀粉溶液3滴，以0.00lmol/L碘酸钾标准溶液滴定，终点为淡蓝色。,C-抗坏血酸标准溶液的浓度，mg/mL；V1-滴定时消耗 0.001mol/L碘酸钾标准溶液的体积，mL；V2-滴定时所取抗坏血酸的体积，mL；0.088-lmL0.001mol碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量，mg/mL,2，6-二氯靛酚溶液的配制和标定 配制：称取2，6二氯靛酚50mg，溶于200mL含有52mg碳酸氢钠的热水中，待冷，置于冰箱中过夜。次日过滤于250mL棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保存。每星期标定1次。标定：取5ml已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入1草酸溶液5ml

21、，摇匀，用2，6二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色，在15s不褪色为终点。,计算:式中：T-每毫升染料溶液相当于抗坏血酸的毫克数，mg/mL；C-抗坏血酸的浓度，mg/mL；V1-抗坏血酸标准溶液的体积，ml；V2-消耗 2，6-二氯靛酚的体积，ml,测定步骤,提取:鲜样的制备:称100g鲜样，加等量的2草酸溶液，于组织捣碎机中打成匀浆。取1040g匀浆于100ml 容量瓶内，用1草酸稀释至刻度，混合均匀。干样的制备:称14g干样放入乳钵内加 l草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用 1草酸稀释至刻度。过滤上述样液，不易过滤的可用离心机沉淀后，倾出上清液过滤备用。,滴定：吸取 510ml滤液

22、，快速用 2,6-二氯靛酚溶液滴定，直到红色不能立即消失，而后再尽快地一滴一滴的加入（样品中可能存在其他还原性杂质，但一般杂质还原染料的速度均比抗坏血酸慢），以呈现的粉红色在15s内不消失为终点。同时做空白。,结果计算式中：x-样品中抗坏血酸含量，mg/100g；T-1mL染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量，mg/mL；V-滴定样液时消耗染料的体积，mL；V0-滴定空白时消耗染料的体积，mL；m-滴定时所取滤液中样品的质量，g。,说明,所有试剂最好用重蒸馏水配制。样品采取后，应浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防止维生素C氧化损失。操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。若测动物性样品，须用10%三

23、氯乙酸代替2%草酸溶液提取。若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白陶土再过滤，过滤后要迅速滴定。若样品中含有Fe2+、Cu2+、Sn2+、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等还原性杂质时，会使结果偏高。,（二）2，4二硝基苯肼比色法,原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼生成红色的脎，在浓硫酸的脱水作用下，可转变为桔红色的无水化合物双-2，4-二硝基苯肼，在浓硫酸中显色稳定，吸光度的大小与总抗坏血酸含量成比，进行比色定量。,操作过程：样品处理氧化 呈色 硫酸处理 比色 数据处理（1）样品制备：同2，6-二氯靛酚滴定法（2

24、）氧化处理：取 25mL上述滤液，加入 2g活性炭，振摇 lmin，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入 10mL 20g/L的硫脲溶液，混匀。,（3）呈色反应：于三个试管中各加入4mL经氧化的样品稀释液,一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0mL 20g/L 2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入（37士0.5）恒温箱或水浴中，保温3h。3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管冷到室温，然后加入 1.0mL 20g/L 2,4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置1015min后放入冰水内。其余步骤同样品。,（4）硫酸（91）处理 当试管放入冰水后，向每一试管中加入5

25、mL硫酸（9十1）滴加时间至少需要1min，（防止溶液温度升高而使部分有机物分解着色，影响空白值），需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。（5）比色 用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。,(6)标准曲线绘制加 2g活性炭于 50ml标准溶液（1mg/mL）中，摇动 1min，过滤。取10mL滤液放入500ml容量瓶中，加 5.0g硫脲，用 10g/L的草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度20g/mL。取5、10、20、25、40、50、60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用 10g/L硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别

26、为1、2、4、5、8、10、12 g/mL。按样品测定步骤进行显色反应并比色。以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（g/mL）为横坐标绘制标准曲线。,计算式中 X-总抗坏血酸含量，mg/100g；-由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度 g/mL V-试样用10g/L草酸溶液定容的体积，ml；F-样品氧化处理过程中的稀释倍数；m-试样质量（10g/L草酸溶液定容后的溶液中试样的质量），g。,说明（1）本法为国家标准方法，适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。（2）活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低，加入量

27、过高，对抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。（3）硫脲可防止抗坏血酸继续氧化，同时促进脎的形成。最后溶液中硫脲的浓度要一致，否则影响测定结果。,（4）试管从冰浴中取出后，因糖类的存在造成显色不稳定，颜色会逐渐加深，30 min后影响将减小，故在加入9+1 的硫酸后30min后准时比色。（5）测定波长一般在495540nm，样品杂质多时在540nm 较合适，但灵敏度较最大吸收波长（520nm）下的灵敏度降低30,HPLC法测定样品中VC含量,优点：选择性强、灵敏度高、快速简单。样品处理：液体样品可过滤后直接进样；固体样品可用草酸或偏磷酸浸泡或经澄清处理后进样。推荐色谱条件：氨基柱或反相离子交换柱 流动相：甲醇-水（5+95）流速：1.5mL/min 波长：254nm,作业：测定维生素A时，为什么要用皂化法处理样品？维生素A和维生素C的测定中，样品处理和提取有何不同之处？为什么？继续练习滴定法测定维生素C,