蛋白质的分离纯化.ppt.ppt

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1、第 七 章 蛋白质的分离、纯化和表征,研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质的功能，首先需要得到纯的、没有变性的蛋白质样品。分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：1.分子的大小和形状、2.酸碱性质、3.溶解度、4.吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力。,第一节 蛋白质的酸碱性质,蛋白质的等电点,蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端氨基和羧基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。可解离基团主要来自侧链上的功能团.对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点

2、（与蛋白质所含氨基酸种类有关）。蛋白质的等离子点是特征常数,蛋白质的电泳,在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。,电泳,利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,第二节 蛋白质分子大小的测定,常用测定方法：,1、根据化学组成测定最低相对分子质量2、凝胶过滤法测定相对分子质量3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分

3、子质量4、渗透压法5、沉降分析法（离心）,一、根据化学组成测定最低相对分子质量,用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子。则可以由此计算出蛋白质的最低相对分子质量。例如，肌红蛋白含铁量为0.335，其最低相对分子质量可按下式算出：最低相对分子质量=（铁的原子量/铁的百分含量）X 100=（55.8/0.335）X100=16700,二、凝胶过滤法测定相对分子质量,凝胶过滤原理,分子筛色谱（凝胶过滤）,利用Andrews的实验经验式：logMr=a/bVe/bVoVe（elution volume）为某一溶质组分的洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰

4、（峰顶）出现时所流出的体积。V0(outer volume)为外水体积，即存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖2000的洗脱体积可以决定V0。,logMr,三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量,聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而成）为支持物。蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电荷效应、分子筛效应)。,如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)和少量巯基乙醇，单体蛋白质或亚基的多肽链处于

5、伸展状态，此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。结果：1、所有的SDS-蛋白质复合体都具有相同的荷质比。2、具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。,变性,？,在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的分子筛效应，电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系：log Mr=abR式中Mr为相对分子质量，a、b都是常数，R是相对迁移率：R=样品迁移距离/前沿（染料）迁移距离,实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其R值作图，根据待测样品的R,从标准曲线上查出它的Mr。,最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于

6、1940年设计）：蛋白质颗粒在2550*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。,v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）,蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系,第三节 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀,一、蛋白质的胶体性质,蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。就其分散程度而言蛋白质溶液属于胶体系统。分散相质点在胶体系统中保持稳定应具备三个条件：,A、分散相的质点大小在1-100nm范围内。动力学上稳定，能作不

7、断的布朗运动。真溶液（1nm）胶体溶液 悬浮液(100nm）B、分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀。C、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层（如水化层）,蛋白质溶液性质：1、蛋白质分子颗粒在1-100nm范围内。2、形成水化层：分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用3、构成稳定的双电层：分子表面上的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。,4、蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,二、蛋白质的

8、沉淀,蛋白质在溶液中的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关，是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的

9、变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱试剂沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,沉淀蛋白质的方法有以下几种：(1)盐析法：向蛋白质溶液中加人大量的中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，又可溶解。,(2)有机溶剂沉淀法 极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。,(3)重金属盐沉淀法(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法(5)加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构

10、解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态（当处于等电点时）。,少量盐类促进蛋白质的加热凝固。（豆腐）我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤(含MgCl2)的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。,点卤时，由于盐卤是电解质，它们在水里会分成许多带电的小颗粒正离子与负离子，由于这些离子的水化作用而夺取了蛋白质的水膜，以致没有足够的水来溶解蛋白质。另外，盐的正负离子抑制了由于蛋白质表面所带电荷而引起的斥力，这样使蛋白质的溶解度降低，而颗粒相互凝聚成沉淀。这时，豆浆里就出现了许多白花花的东西了。盐卤里有许多电解质，主要是钙、镁等金

11、属离子，它们会使人体内的蛋白质凝固，所以人如果多喝了盐卤，就会有生命危险。,第四节 蛋白质分离纯化的一般原则,分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为：1、前处理 2、粗分级分离 3、细分级分离,1、前处理(pretreatment),分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。,动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组

12、织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎，液氮破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理(以分解肽聚糖)等。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。,如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开,如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。,2、粗分级分离(roug

13、h fractionation),当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质(包括脱盐)，又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、冷冻真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓缩。,3、细分级分离(fine fractionation),进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的

14、纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。,4、结晶,结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的，结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。,第五节 蛋白质的分离纯化方法,几种常用的蛋白质纯化方法：,根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法：分子大小；溶解度；电荷；吸附性质

15、；对配体分子的生物学亲和力等。,一、根据分子大小不同的纯化方法,1透析和超过滤 透析(dialysis)是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸和其他改型的纤维素材料。,超滤是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。,2密度梯度(区带)离心,蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立的区带，,密度梯度,常用的密度梯度有蔗糖梯

16、度，聚蔗糖梯度。蔗糖便宜，纯度高，浓溶液(60，WW)密度可达1.28 gcm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1氯2，3环氧丙烷合成的高聚物，Mr约400 000。密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大，向上逐渐减小,3凝胶过滤层析(分子排阻),（1）凝胶过滤的介质 凝胶过滤所用的介质是凝胶颗粒，其内部是多孔的网状结构，,经常使用的凝胶种类：,（1）葡聚糖凝胶，是由线形的1，6葡聚糖与1氯2，3葡聚糖环氧丙烷反应而成的化合物，它的商品名称为Sephadex。不同型号的Sephadex 用G来表示。G后面的数字-10、200表示吸水量为1、20克/克干胶。如Sephadex G-

17、100,交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。交联度越高，凝胶孔径越小。,G10、15、25 分离范围5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离，胶柱长要求15-25厘米。G-50 分离范围 1500-30000 G-75 分离范围 3000-80000 G-100 分离范围 4000-150000G-200 分离范围 5000-600000适用于各类生物分子的分离，胶柱长要求80厘米以上。,（2）聚丙烯酰胺凝胶(商品名称为Bio-gel P)是一种人工合成的凝胶，它是由

18、单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)共聚而成的。不同型号的Bio-gel 用P来表示。P后面的数字再乘以1000为该型号的排阻极限，表示当某一物质的分子量大于或等于某一值时，完全不进入凝胶。如Bio-gel P-60,（3）琼脂糖凝胶 商品名称为Sepharose或Bio-Gel A，琼脂糖是从琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点是孔径大，排阻极限高。不同型号的Sepharose 用B来表示。B前面的数字表示凝胶中含干胶的量，如 Sepharose 6B,二、利用溶解度差别的纯化方法,影响蛋白质溶解度有：自身因素：在同一的外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根

19、结底取决于它们本身的分子结构，例如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团与疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等。外部因素：很多，其中主要有：溶液的pH，离子强度，介电常数，温度。,1.pH控制蛋白质的沉淀,蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。,2.蛋白质的盐溶和盐析,盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。,由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强

20、，因而溶解度增高,盐溶,盐析：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out）。,大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。导致蛋白质表面的疏水基团的暴露,盐析（NH4）2SO4、Na2SO4）,3有机溶剂分级分离法,与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。,有机溶剂分级分离的机理,有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改

21、变了介质的介电常数。水是高介电常数物质(20时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。,4温度对蛋白质溶解度的影响,在一定温度范围内，约040之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，在4050以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解能力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分

22、离操作一般都在0或更低的温度下进行。,三、根据电荷不同的纯化方法,根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类 一.电泳(electrophoresis)在外电场的作用下，带电颗粒，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质电泳分离原理：分子大小不同的蛋白质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移率不同，因此，在电泳时可以分开。,1、电泳的类型,目前电泳的类型很多，最常见的是区带电泳，由于在支持物上电泳时蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。,区带电泳按其支持物的物理性状不同可以分成4类：滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳)；粉末电泳

23、，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；,细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳；凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高，,2、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylaminde gel electrophoresis，简称PAGE),也称圆盘电泳，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,一般制作成凝胶柱或凝胶板，,垂直板电泳的优越性：,表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰；在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的 电泳，

24、便于在同一条件下比较分析鉴定，还可 用于印迹转移电泳及放射自显影；胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率 高，不仅可用于分析，可用于制备；胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于 长期保存与扫描；可进行双向电泳。,按其凝胶的组成系统可分成四种：,(1)连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的pH值和相同的缓冲液。(2)不连续凝胶电泳：采用二层或三层性质不同的凝胶(即：样品胶、浓缩胶和分离胶)重叠起来，使用两种不同的pH值（6.7和8.3）和不同的缓冲液（Tris-HCl和Tris-Gly）(3)孔梯度凝胶电泳：采用梯度混合装置，使制得的凝胶由上至下孔径逐渐减小(即凝胶浓度由上至下逐渐增高)。梯

25、度凝胶电泳主要适宜于测定球蛋白的相对分子质量。,(4)SDS凝胶电泳：在聚丙烯酰胺凝胶中加入 SDS(十二烷基硫酸钠)(5)等电聚焦凝胶电泳：(IEF-PAGE)在电泳支持介质中加入载体两性电解质(carrier ampholytes)，通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点。,3、凝胶聚合的原理及有关特性,1聚合反应 凝胶的聚合单体:丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)；常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。TEMED的碱基可催化AP水溶液产生游离氧原子，激活

26、Acr单体，使其聚合成单体长链，在Bis作用下，聚合成网状凝胶（化学聚合）。碱性条件下凝胶易聚合，室温下7.5的凝胶在pH8.8时30min聚合，在pH4.3时约需90min。此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照（光聚合），故使用不多。,凝胶的孔径随着Acr 的浓度的变化而变化，也跟Bis的浓度有关T=(a+b)/m l00c=b/(a+b)100式中 a：Acr克数；b：Bis克数；m：缓冲液体积(ml)。T：Acr和Bis总浓度 c：交联剂百分比,再按要求配制不同浓度的凝胶。注意点：1、Acr-Bis贮液在自然光、射线、超声波的引发下会发生聚合，故应放在棕色瓶中避光保存。30%的贮液4下只

27、能保存一个月。2、Acr、Bis均为神经毒性，勿触及皮肤和粘膜。3、过硫酸铵应现配现用。,凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系,T,凝胶的孔径与样品的迁移率有关,A,B,迁移率随着凝胶浓度的变化 而变化单一条带不能说明是一种组分,连续系统：电泳体系中缓冲液、pH值及凝胶浓度相同，即只有分离胶。带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷效应和分子筛效应，无浓缩效应。,4、连续凝胶系统和不连续凝胶系统,不连续系统：一般常用二层或三层。由上而下分为：1、样品胶 2、浓缩胶 3、分离胶 电泳体系中各层胶中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度都不同。,样品胶：T=3，c=2.6，缓冲液为pH6.8的Tris-

28、HCl，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。目前，一般不用样品胶，直接将样品加入蔗糖或甘油后加在浓缩胶的表面，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。,浓缩胶：T=5，c=2.6的大孔胶，缓冲液为pH6.8的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。浓缩效应 分离胶：T=7.0一20%，c=2.5的小孔胶，缓冲液为pH8.9的Tris-HCl，大部分蛋白质在此pH条件下带负电荷，样品在该层被分离。电荷效应和分子筛效应，,不连续PAGE电泳的3种物理效应：,样品的浓缩效应；凝胶对被分离分子的筛选效应(颗粒小的移动快，颗粒大的

29、移动慢)；一般电泳分离的电荷效应。由于这3种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。人血清用纸电泳只能分成57个组分，而圆盘电泳则可分成几十个清晰的条带。,样品浓缩效应(由三种不连续性造成),（1）凝胶孔径的不连续性 上述三层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。,浓缩胶,分离胶,(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性,HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。在电极缓冲液中，除有Tris外，还

30、有甘氨酸，其pI=6.0，在pH8.9的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2CH2COO)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.11，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。,Tris-HClpH=6.7,pH=8.9,Gly,Cl-,Gly-,Tris-HCl,带负电的蛋白质,迁移率介于快离子与慢离子之间,+,电泳缓冲体系，Tris-Gly,pH=8.3,(3)电位梯度的不连续性,电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。,分子筛效应,大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的

31、迁移率，这就是分子筛效应。蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。,电荷效应,在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则迁移慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带。,4、SDS凝胶电泳：,5、等电聚焦(isoelectric focusing，IEF),等电聚焦是60年代建

32、立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析技术。它是利用蛋白质分子或其他两性电解质分子具有不同的等电点，从而在一个稳定、连续、线性的pH梯度中得到分离。近年来，等电聚焦电泳技术的分辨率有了很大提高，可以分辨pI只差0.01的生物大分子，这是等电聚焦最突出的优点，,蛋白质等电聚焦电泳的基本原理,在电泳支持介质中加入载体两性电解质(carrier ampholytes)，通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点。,当蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。如果它向等电点两侧扩散，净电荷就不

33、再为0，都会被阴极或阳极吸引回来，直至回到净电荷为0的位置，因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带。这种效应称之为“聚焦效应”。保证了蛋白质分离的高分辨率，是等电聚焦最为突出的优点。,1、分辨率高，可以分辨pI只差0.010.02的生物大分子。2、随着电泳时间的延长，区带越来越窄。其他电泳区带会越来越宽。3、样品可以加在胶板的任何部位。4、很稀的样品都可以分离，且重现性好。5、可以用来测定蛋白质或多肽的等电点。,蛋白质等电聚焦电泳的特点,pH梯度的产生方式,产生pH梯度的方式有两种：（1）一种是人工pH梯度，但由于缓冲液离子的电迁移和扩散使pH梯度不稳定（2）另一种是自然

34、pH梯度，即在凝胶中加入载体两性电解质，在电场作用下形成连续的pH梯度，凝胶的防对流扩散作用使pH梯度保持稳定。,载体两性电解质的合成,1961年Svensson 提出的载体两性电解质的理论基础，1964年Vesterberg 利用多乙烯多胺和不饱和酸合成了载体两性电解质，它是由脂肪族多氨基多羧基的异构物和同系物组成，它们有连续改变的氨基与羧基比。,合成反应是不饱和酸如丙烯酸与多乙烯多胺的加成反应，调节胺和酸的比例，就可以得到带有不同比例氨基与羧基的脂肪族多氨基多羧酸，多乙烯多胺链越长，加成方式也越多，所得载体两性电解质的pI也越连续，在电场作用下，可以形成平滑而连续的pH梯度。,1966年瑞

35、典LKB公司生产出第一批载体两性电解质，商品名为Ampholine，Serva公司的Servalyte，BioRad公司的Biolyte，Pharmacia公司的Pharmalyte，国内军事医学科学院放射医学研究所生产的载体两性电解质等。,载体两性电解质形成pH梯度的机理,载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在2.510之间，在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶在凝胶中，电泳时在电场作用下，载体两性电解质分子将向正极或负极方向泳动，逐渐到达它们自己的等电点位置而形成一个连续的pI梯度,双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis),6.毛细管电泳(ca

36、pillary electrophoresis),CE 又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管分离法（CESM）。毛细管电泳是以弹性石英毛细管（内径为25-100微米散热性好）为分离通道，以高压电场（可高至30千伏）为驱动力，依据样品中各组分之间带电性和分配行为上的差异而实现的电泳分离的分析方法。它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平。,毛细管电泳的原理,电渗：在水性条件下大多数固体表面都带有多余的负电荷。构成毛细管的熔融石英由硅醇(-SiOH)组成,它在水溶液中以-SiO-形式存在，为了维持电荷平衡，溶液中的正离子吸附至石英表面形成双电层，当两端施加电压后这一层正离子趋向负极移动，并带动毛细

37、管中的溶液以液流的形式移向负极，此现象称为电渗或电渗流。,由于电渗速度一般比样品的电泳速度大，使得携带不同电荷的分子朝一个方向运动。不带电荷的中性分子也能随电渗流一起移动。对荷正电的分子来说，电泳迁移和电渗流效果是一致的，因而移动最快，最先达到负极。对荷负电的分子来说，电泳迁移和电渗流效果相反，因而移动最慢，最后达到负极。,+,毛细管电泳高效分离、快速分析和微量进样的优势，使其在化学、生命科学、药物学、法医学、环境科学、农学及食品科学等领域有着十分广泛的应用，适合于从无机离子到生物大分子，从荷电粒子到中性分子的分离分析。HPCE最大的优点之一就是应用范围广泛，可用于分析氨基酸、手性药物、维生素

38、、杀虫剂、无机离子、有机酸、染料、表面活性剂、肽和蛋白质、糖类、低聚核苷酸和DNA限制性内切片段，甚至整个细胞和病毒颗粒。,毛细管电泳的应用,四、利用选择性吸附的纯化方法（吸附层析）,某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸物质的性质而异。吸附过程涉及范德华相互作用和氢键这些非离子吸引力。吸附层析就是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的的。,典型的吸附剂,硅胶:在其表面含有硅烷醇(SiOH)，呈微酸性，它适用于分离碱性物质。氧化铝:微碱性，适于分离酸性物质。活性炭:是一种非极性吸附剂。为了获得好的分离

39、效果，需要选择合适的洗脱液。一般选择其极性与待分离的混合物中极性最大组分的极性相当的洗脱液。,五、利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法（亲和层析）,亲和层析(affinity chromatography)是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力（底物和酶，抗原与抗体，酶与抑制剂，受体与底物等），建立起来的一种有效的纯化方法。它经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。,亲和层析的基本步骤：,离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。A、定义：是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对溶液中各种离子的结

40、和力不同而达到分离目的的一种层析分离技术。,离子交换层析,B、离子交换剂,母体：不溶性高分子。如纤维素、凝胶、树脂。琼脂糖、葡聚糖等可解离基团：,酸性基团：-SO3H（SE强酸型）、COOH（CM弱酸型）也称阳离子交换剂碱性基团：-NH2（AE，弱碱型），-N（CH3）2（DEAE），-N+（CH3）3（强碱型）、也称阴离子交换剂,阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。如磺酸基(一S03H)，磷酸基(一P03H)，亚磷酸基(一PO2H)，羧基(一COOH)，酚羟基(一OH)等。引入酸性基团的交换剂可离解出H+，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。根据电荷基团的强

41、弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型(带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基或酚基)三种。RAH+Na+=RANa+H+,阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺一N+(CH3)3、叔胺一N(CH3)2、仲胺一NHCH3和伯胺一NH2基团构成的。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。引入含氨基碱性基团的交换剂，可与OH结合后，与其他阴离子交换，属于阴离子交换剂。R一N+(CH3)30H一十C1=RN十(CH3)3C1+OH,为了使蛋白质从离子交换柱上洗脱下，需要降低它们之间的亲和力，有效的方法是逐步提

42、高洗脱剂的pH和盐浓度(离子强度)，这样各种蛋白质将以不同的速度被洗脱下来。,离子交换层析及洗脱,(1)采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，(2)采用改变洗脱的盐浓度或pH的方式洗脱，又可以分为两种：一种是跳跃式的分段洗脱另一种是渐进式的梯度洗脱。一般分离效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多采用梯度洗脱。,梯度洗脱的类型,通常采用的梯度形式有线性(形)，凸形，凹形和复合形四种，使用最多的是线性梯度。为获得这些梯度设计出多种梯度混合器,K=(CRCM)/V,第六节蛋白质的含量测定与纯度鉴定,一、蛋白质含量测定,目前总蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物

43、理性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定得知，另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂法(又名Lowry法)。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求及实验室条件进行选择。原理都是利用蛋白质的成色反应或紫外吸收的性质，通过分光光度法来测定。,1.凯氏定氮法,是经典的标准方法，用浓硫酸消化蛋白质分解出氨，测定氨的含量，除以16%，就得出蛋白质的含量。,2.双缩脲法,蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。凡含有双缩脲相似结构的物质均能参与反应，常用于需要快速但并不需要

44、十分精确的测定。,3.Lowry法(Folin-酚法),Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。相当于双缩脲试剂。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝混合物），蛋白质中含有带酚基的酪氨酸，故有此反应。因此Folin-酚法测定蛋白质含量灵敏度较高。,目前实验室多用Folin-酚法测定蛋白质含量。此法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏1020 倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种

45、因素干扰。在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除。,4.紫外吸收法,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。,紫外吸收法的优缺点：,优点：简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)广泛应用。缺点：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。,5.考马斯亮蓝染色法,蛋白质的存在，会影响酸

46、碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在此基础上，发展蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫，目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。,考马斯亮蓝R-250和蛋白质通过范德华键结合，呈蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质的染色符合比尔定律。25min即呈现最大光吸收，至少稳定1h。本方法可允许的测定范围是220ug蛋白质。受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质的染色强度差别不大。,6.胶体金测定法,胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，呈洋红色，遇蛋白质转变为蓝色，颜色改变与蛋白质有定量关系，是几种方法中灵敏度最高的，检测量是ng水平

47、。,7.某一特定蛋白质的含量测定,通常要用具有高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量。有些蛋白质虽然没有酶或激素那样特异的生物学活性，但是大多数蛋白质当注入适当的动物血液中时，会产生抗体。因此，利用抗体抗原反应，也可以测定某一特定蛋白质的含量。,二、蛋白质纯度的鉴定,蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：（1）电泳：目前采用的电泳分析有等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDSPAGE、毛细管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带(或峰)。（2）离心沉降：纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动,二、蛋白质纯度的鉴定,（3）HPLC：常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。（4）溶解度分析：（5）N末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只可能有一种氨基酸。,（6）酶的纯度的鉴定,纯化程度：通常用这一特定成分的含量(一般用活力单位)与总蛋白量（重量单位）之比来表示。对酶来说常以每毫克蛋白所含活力单位数表示，称为酶比活或比活力。纯化工作一直要进行到这个比活不再增加为止*酶活性单位定义为在标准实验条件下催化产生1mol产物/min所需的酶量。,