4——细胞化学染色.ppt.ppt

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1、临床血液学与检验-细胞化学染色,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,骨髓报告细胞化学染色,铁染色,中性粒细胞碱性磷酸酶（ALP）,过氧化物酶（POX）苏丹黑,糖原（PAS）,酸性磷酸酶（ACP）,细胞化学染色,主要内容Contents,细胞化学染色检验,酯 酶 染 色,第二节、细胞化学染色检验 P74,定义：血细胞化学染色是以形态学为基础，根据化学反应原理,将骨髓片染色,观察单个细胞内的各种化学成分、代谢产物等，了解它们的代谢活动和生理功能。鉴别各种类型血液细胞,细胞化学染色的临床应用,辅助判断白血病的细胞类型辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断观察疾病的疗效和预后发病机制的探讨,细胞化学染色

2、检验,细胞化学染色方法,酶 脂类 糖原 铁,造血检验的基本方法,固定,蒸汽固定甲醛 液体固定-甲醛、乙醇、甲醇、丙酮；,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,有色沉淀反应,偶氮偶联法-NAP、SE、NSE、ACP联苯胺法-POX普鲁士兰反应-Fe雪夫反应-PAS金属沉淀法-NAP-钙钴法,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,复染,使各种细胞有明显的对比度中性红甲基绿核固红亮绿,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,一、铁染色,原理：4Fe3+3K4Fe(CN)6 含铁物质 亚铁氰化钾 Fe4Fe(CN)63+12K+亚铁氰化铁,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,结果判断,造血检验的基本方

3、法,细胞化学染色检验,细胞外铁：存在于骨髓小粒的巨噬细胞中的蓝色颗粒 外铁：+(+)约2/3人 约1/3人(+)细胞内铁：存在于有核红和成熟红细胞内的铁；铁粒幼红细胞阳性率:19%44%无环形铁幼细胞及铁粒红细胞,细胞外铁,观察骨髓小粒中的铁 阳性呈弥散性、颗粒状、小珠状或块状蓝色,细胞外铁（Extracellular iron）,细胞化学染色检验,细胞外铁判定标准,实验结果 显微镜下表现（-）无颗粒（+）有少数颗粒或偶见铁小珠（+）有较多铁颗粒或铁小珠（+）有很多铁颗粒、铁小珠及少数铁小块（+）有极多铁颗粒、铁小珠，很多铁小块密集 成堆,细胞外铁（高倍镜）,细胞化学染色检验,幼红细胞核呈鲜红

4、色，浆呈淡黄红色。铁粒呈蓝色，定位于胞质内。根据铁颗粒的多少、粗细将铁粒幼红细胞分为 以下几种类型：Type I:幼红细胞内含铁粒12粒 Type II:幼红细胞内含铁粒35粒 Type III:幼红细胞内含铁粒610粒 Type IV:幼红细胞内含铁粒10粒,细胞内铁（Intracellular iron）,铁粒红细胞（Siderocyte）:成熟红细胞中出现铁颗粒称为铁粒红细胞。铁粒幼红细胞（Sideroblast）:胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。环形铁粒幼红细胞（Ringed sideroblast）：幼红细胞胞质内蓝色颗粒多于6个，围绕核周1/2以上的铁粒幼红细胞。,细胞内铁 阳性

5、阴性,细胞化学染色检验,细胞内铁（环状铁粒幼红细胞）幼红细胞胞质内蓝色颗粒多于6个，围绕核周1/2以上的铁粒幼红细胞,细胞化学染色检验,临床评价1.鉴别 IDA 与 非缺铁性贫血2.铁粒幼细胞性贫血3.骨髓增生异常综合症4.非缺铁性贫血,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,二 中性粒细胞碱性磷酸酶染色（neutrophil alkaline phosphataseNAP）（偶氮偶联法）,原理 磷酸萘酚钠 NAP 萘酚+重氮盐偶联 PH9.6（亮红色沉着于胞浆中）结果 NAP主要存在于成熟中性粒细胞，其他血细胞均呈阴性反应。,细胞化学染色检验,中性粒细胞碱性磷酸酶染色（neutrophil a

6、lkaline phosphatase NAP）（钙钴法）,原理-甘油磷酸钠 NAP 甘油+磷酸钠 NaHPO4+Ca（NO3)2+（NH4）SCO 棕黑色（沉着于胞浆中 结果 NAP主要存在于成熟中性粒细胞，其他血细胞均呈阴性反应。,细胞化学染色检验,1、胞浆中出现灰色到棕黑色沉淀者为阳性。,2、反应强度分为五级：-+淡红 淡灰 灰黑 浅棕黑 深棕黑色 3、百分率：计数100个成熟中性粒细胞，计算 阳性率。4、积分法：计数100个成熟粒细胞，按反应强度作 出分级，将其百分率乘以级数，然后 相加。,细胞化学染色检验,细胞化学染色检验,NAP 积分法计算100个成熟中性粒细胞的积分积分=(+)数

7、量1+(+)数量2+(+)数量3+(+)数量4百分率=100个细胞中阳性细胞总数即为阳性率参考值:30130分（各单位应建立自己实验室的参考值）,注意事项1.标本要新鲜，否则酶活性会下降2.每次染色最好做阳性对照,细胞化学染色检验,类白血病反应 慢粒白血病反应,细胞化学染色检验,参考值 正常：阳性率：4089%积分：14-113分临床意义 1.区别CML、类白血病反应 积分为0;积分200分 2.急粒 积分;急淋 积分;急单 N或 3.AA时 PNH 4.化脓性感染 病毒性感染时,细胞化学染色检验,慢性粒细胞性白血病Chronic myeloid leukemia,细胞化学染色检验,慢粒 阴性

8、,细胞化学染色检验,急性淋巴细胞白血病,急性化脓性感染NAP染色,慢性粒细胞性白血病 ALPChronic myeloid leukemia 阴性,三、过氧化物酶染色(Peroxidase,POX)）,原理 联苯胺法 H2O2 细胞内 POX O 联苯胺 O 联苯胺蓝+亚硝基氰化钠 暗蓝色颗粒(定位于胞浆内)结果 粒系：强阳性 单核系：弱阳性 淋巴系：阴性 临床意义 鉴别急粒和急淋,细胞化学染色检验,过氧化物酶染色(Peroxidase,POX)）二氨基联苯胺法,原理 H2O2 细胞内 POX O 二氨基联苯胺 O 金黄色颗粒(定位于胞浆内)结果 粒系：强阳性 单核系：弱阳性 淋巴系：阴性 临

9、床意义 鉴别急粒和急淋,细胞化学染色检验,1 min,6 min,操作步骤,新鲜涂片,复方联苯胺溶液(或二氨基联苯胺）,加入等量1%过氧化氢溶液,水洗，待干，瑞氏复染1520 min,水洗，待干，镜检,注意事项（1）标本要新鲜（2）掌握好H2O2的浓度，并要新鲜（3）在弱酸性环境中显色较为稳定（PH5.5）（4）加试剂要充分混匀，使染色均匀,POX结果判断,实验结果 细胞表现（-）无颗粒（+）颗粒粗大聚集，约占胞浆面积1/4（+）颗粒弥散状分布，有一定空隙，约占胞浆面 积1/2（+）颗粒均匀分布于胞浆或聚集，约占胞浆面积3/4（+）颗粒充满整个胞浆，无空隙,过氧化物酶（POX）,细胞化学染色检

10、验,红细胞系统阴性,正常骨髓POX染色,各型白血病的POX反应,粒系白血病细胞 淋巴细胞白血病细胞,细胞化学染色检验,临床评价,1.辅助鉴别急性白血病的类型 急性粒细胞白血病 AML（+）急性淋巴细胞白血病 ALL（-）(阳性率3)急性单核细胞白血病 AMOL（-/）,POX（+）可排除ALL,但POX（-）并不能排除ANLL或AMOL。,2.辅助鉴别急性早幼粒细胞白血病（APL)、急性单核细胞白血病（AMOL)、恶性组织细胞病（MH)APL 呈强阳性反应 AMOL 呈弱阳性反应 MH 呈阴性反应,临床评价,四、苏丹黑B染色(Sudan black B,SBB),原理 苏丹黑B（脂溶性染料）细

11、胞质内含脂结构 棕黑色或深黑色 结果 粒细胞系统：阳性（黑色粗大）单核细胞系统：阳性（黑色细小）其他细胞：阴性,细胞化学染色检验,临床意义,大致同POX;可用陈旧骨髓片,细胞化学染色检验,苏丹黑B染色临床意义,基本与POX染色相同，但其灵敏度及特异性有所不同。SB染色的特异性低于POX，POX阳性主要见于髓系细胞。SB染色的灵敏度高于POX，如急性粒细胞白血病POX染色阴性的患者，SB可见呈阳性。,五、糖原染色（过碘酸-雪夫反应）(periodic acid Schiff,PAS),【原理】过碘酸 细胞内的糖原氧化 双醛基+无色品红（雪夫碱）紫红色沉淀,细胞化学染色检验,涂片于95乙醇固定10

12、 min（DW冲洗）,高碘酸氧化1520 min，冲洗，待干,雪夫染液染色3060 min,亚硫酸溶液冲洗3次，每次2 min,水洗，待干，镜检,甲绿复染1020 min,操作步骤,注意事项 1.雪夫氏试剂变红无效 2.结果观察要及时，长期保存会褪色,正常血细胞的染色反应,粒细胞系统:分化差原粒呈阴性早幼粒以下均呈阳性，随细胞的成熟阳性程度逐渐增强嗜酸粒细胞颗粒不着色,颗粒间胞质呈阳性嗜碱性粒阳性,呈粗颗粒或块状,正常血细胞的染色反应,红系:有核细胞及成熟红细胞均呈阴性淋巴系:大多数呈阴性,少数呈阳性,粗颗粒巨核系及血小板:均为阳性,块状或颗粒状其它:浆细胞少数可呈阳性,巨噬细胞呈细颗粒阳性,

13、正常血细胞的染色反应,单核系 原始单核:阴性 幼单核:(+)成熟单核:(+)(+)细颗粒弥散阳性,胞浆边缘粗颗粒,中性粒细胞PAS染色分级标准,实验结果 细胞表现（-）胞质无色（+）胞质呈淡红色，薄而透明，颗粒不明显，边缘有极少深红色颗粒（+）胞质呈红色，厚而不透明，有少量颗粒或边缘有较多深红色颗粒（+）胞质呈深红色，颗粒多或呈片状，颗粒较紧密，颗粒间尚有空隙（+）胞质呈深紫红色，颗粒紧密，颗粒无空隙,各系细胞糖原结果判断,细胞化学染色检验,淋巴细胞PAS染色分级标准,实验结果 细胞表现（-）胞质无色（+）胞质内呈弥散淡红色或有少数细颗粒（10个）（+）胞质内呈弥散较深的红色或有多数红色细颗粒

14、（10个）（+）胞质内有较多红色粗颗粒或少数小块状红色物质（+）胞质内有多数红色粗颗粒并有大块状红色物质,各系细胞糖原结果判断,细胞化学染色检验,有核红细胞PAS分级标准,实验结果 细胞表现（-）胞质无色（+）胞质内有少数分散细小红色颗粒或浅红色弥漫物质（+）胞质中有110个中等大小的红色颗粒或弥漫较多的细小红色颗粒（+）胞质中有1120个中等大小的红色颗粒或弥漫细小红色颗粒，颗粒间有一定空隙（+）胞质中有粗大红色块状物质或有粗大致密的紫红色颗粒,红血病、红白血病（原始红细胞）,细胞化学染色检验,巨核细胞PAS染色分级标准,实验结果 细胞表现（-）胞质内无红色颗粒，但细胞内弥散性红色，此系其它

15、多糖物质所致（+）胞质内含有数小块或一大块糖原，常定位于近核膜处（+）胞质内含有许多小块或较多大块糖原，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的1/3(+)胞质内含有许多大块糖原,分散于胞质中,占胞质1/2(+)糖原包涵体充满整个胞质,各系细胞糖原结果判断,细胞化学染色检验,临床应用,急性白血病类型鉴别：ALL-原幼淋巴多数阳性，粗颗粒或块状阳性AML-原粒细胞阴性或阳性，呈弥散阳性APL-早幼粒细胞呈弥散阳性，呈弥散阳性AMOL-原幼单核呈阴性或阳性，细颗粒状，胞质边缘及伪足处颗粒粗大红血病及红白血病-幼红细胞呈阳性或强阳性巨核细胞白血病-呈阳性或强阳性，呈颗粒状或块状,红血病、红白血病（原始

16、红细胞）,细胞化学染色检验,淋巴细胞 巨核细胞,急淋 巨核细胞白血病,细胞化学染色检验,鉴别各类贫血,MDS-幼红细胞呈阳性或强阳性IDA、珠蛋白合成障碍性贫血-阴性或弱阳性巨贫、溶贫及AA-阴性,鉴别其他疾病,戈谢细胞 尼曼-匹克细胞 强阳性 弱阳性 NHL淋巴瘤细胞 HD(R-S细胞)粗颗粒或块状 弱阳性或阴性骨髓转移癌腺癌细胞呈强阳性,临床评价,阳性或强阳性：红细胞系统疾病：红血病、红白血病、MDS淋巴细胞系统疾病：急淋（原淋、幼淋巴细胞）、慢淋、恶性淋巴瘤巨核细胞系统疾病 巨核细胞白血病,细胞化学染色检验,（六）、酯酶染色 esterase,萘酚AS-D氯乙酸酯酶（NAS-DCE）t,

17、-醋酸萘酚酯酶（-NAE）,醋酸萘酚酯酶（NAS-DAE）,D,-丁酸萘酚酯酶（-NBE）,特异性酯酶 粒细胞酯酶,中性非特异性 酯酶,中性非特异性酯酶,单核细胞酯酶 非特异性酯酶,酯酶染色 Esterase Staining,方法 偶氮偶联法1 特异性酯酶染色 氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（Specific Esterase Staining）2.非特异性酯酶染色 Non-Specific Esterase Staining）,-醋酸萘酚酯酶染色（a-NAE),-丁酸萘酚酯酶染色（a-NBE）,醋酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DAE）,（NAS-DCE）,分类,（一）氯乙酸AS-D萘酯酶染色

18、naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE,原理：氯醋酸AS-D萘酚 AS-D NCE AS-D萘酚 H2O 不溶性红色沉淀+坚牢酱紫,细胞化学染色检验,结果 阳性反应为胞质中出现红宝石色颗粒 1 粒细胞系统（+）2 单核细胞系统 大多数（-），个别（）3 肥大细胞（+）4 其他细胞（-）,粒细胞特异性酯酶染色,（二）-醋酸萘酚酯酶(-NAE)(-naphythyol acetate esterase）,-醋酸萘酚 NAE-萘酚+重氮盐（坚牢蓝B）棕黑或灰黑色（胞浆中）,细胞化学染色检验,-醋酸萘酚酯酶-NAE 染色结果（非特异性酯酶）,细胞化学

19、染色检验,急性单核细胞白血病acute monocytic leukemia,细胞化学染色检验,临床评价,鉴别白血病类型；同时必须做NaF抑制试验,细胞化学染色检验,2张相同标本同时固定后，配制2缸孵育液，其中一缸内加入NaF（抑制酶活性），然后将2张标本分别放入2个缸内各自染色。最后分别进行积分，求出抑制率。（50）,氟化钠抑制试验（NaF Inhibit test）,NaF抑制率,抑制前阳性率或积分,抑制后阳性率或积分,抑制前阳性率或积分,100,-,细胞化学染色检验,非特异性酯酶染色,细胞化学染色检验,结果,急性粒细胞白血病-原粒细胞弱阳性，不被NaF抑制急性单核细胞白血病-原单核细胞阳

20、性，被NaF抑制；,细胞化学染色检验,非特异性酯酶+NaF,-丁酸萘酚酯酶染色,原理:-丁酸萘酚酯酶在碱性条件下，水解其基质液中-丁酸萘酚并释放出-萘酚，后者与基质中重氮盐偶联形成不溶性有色沉淀，定位于细胞质酶所在部位一。,-丁酸萘酚酯酶染色,正常血细胞染色反应粒系:(-)单核系:分化差原单(-),分化原单好(+),幼单及成熟单核(+),+NaF抑制淋巴系：T淋巴、非T非B淋巴（+），B细胞（-）其它细胞：巨核、幼红、浆细胞（-）或（），组织细胞（+）+NaF未抑制,-丁酸萘酚酯酶染色结果,酯酶双染色,-醋酸萘酚酯酶+氯乙酸AS-D萘酚酯酶-丁酸萘酚酯酶+氯乙酸AS-D萘酚酯酶临床多用：ANL

21、L-M4,酯酶双染,两种酯酶在同一张片子上染色,细胞化学染色检验,一种特异性酯酶染色加一种非特异性酯酶染色临床意义：粒、单核细胞白血病（M4）,酯酶双染,注意事项,标本必须新鲜，应于取材后两天内染色。重氮盐的选择。,七、酸性磷酸酶（acid phoshatase ACP),原理：硫化铅和偶氮偶联法结果：胞质内出现棕黑色颗粒者为阳性（硫化铅）胞质内出现亮红色颗粒者为阳性（偶氮偶联法）,细胞化学染色检验,1 偶氮偶联法 磷酸萘酚AS-BI 萘酚AS-BI 六偶氮付品红 红色沉淀,ACP,pH5.0,方法及原理,3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色(T-ACP)ACP共有7种同工酶(isoenzyme)(0、

22、1、2、3、3b、4、5)，其中同工酶5的活性不被左旋酒石酸抑制。,L-Tartaric acid,L-Tartaric acid,(-),(+),结果 胞质中有棕黄或棕黑色颗粒状或片状沉淀为阳性。,临床意义 鉴别多毛细胞白血病，不被L-酒石酸所抑制,细胞化学染色检验,毛细胞白血病细胞,细胞化学染色检验,HCL T-ACP染色,骨髓细胞学检查,鉴别Gaucher病与Nienann-Pick病 阳性 阴性,细胞化学染色检验,鉴别T细胞白血病 B细胞白血病 阳性 阴性,B细胞白血病形态 ACP阳性,细胞化学染色小结,四种常见类型急性白血病的染色结果 M3 M1、M2a M5 ALLPOX染色 3+

23、-4+2+或-或+/-SB染色 3+-4+2+或-或+/-，个别+NAE-DCE 3+-4+2+或-或+/-NAS-DAE 3+-4+-或+，2+-4+-或+NAS+NaF 不抑制 不抑制 抑制 抑制-NBE染色-+-NBE染色+NaF/抑制/PAS+呈弥散状+呈弥散状+呈细颗粒+呈粗颗粒状,本节主要内容,常见的细胞化学染色及临床应用（Fe、ALP、POX、NEC、ACP、PAS、铁染色）,骨髓细胞学检查,分析这些染色结果,1.POX强阳性，-NAE弱阳性，不被NaF抑制 应该是：粒细胞？单核细胞？淋巴细胞？,2.为了鉴别慢性粒细胞白血病（CML）和类白血病反应,下列首选实验是：1）SB 染色

24、 2）PAS 染色 3）NAP 积分 4）ACP 染色 5）POX 染色,分析这些染色结果,3.哪些异常细胞的PAS可呈阳性 1）红白血病中的有核红细胞 2）溶血性贫血中的有核红细胞 3）巨幼细胞贫血中的有核红细胞 4）淋巴细胞白血病中的原始细胞 5）戈谢细胞,分析这些染色结果,思考题,1.细胞化学染色的基本步骤包括哪些？2.急性白血病一般要做哪些细胞化学染色？3.POX、NAP、PAS、NAS-DCE、-NAE和铁染色的临床评价,参考书目,1.临床血液学检验 主编 胡翊群 中国医药科技出版社2.实验诊断学图谱 主编 张丽霞 陈金宝 上海科技出版社3.现代血细胞学图谱 主编 王淑娟 王建中 吴振茹 人民卫生出版社4.现代血液病学 主编 达万明 裴雪涛 人民军医出版社5.实验诊断学 主编 王鸿利 人民卫生出版社6.现代血液形态学理论与实践 主编 卢兴国 上海科学技术出版社,谢 谢！,