第三章_基因工程制药.ppt.ppt
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1、第三章 基因工程制药 一、基因工程药物 二、基因工程制药基本技术 三、基因工程制药实例,作业 查阅资料,介绍某种基因工程药物的生产工艺。,一、基因工程药物,1982年第一个基因重组产品人胰岛素在美国Eli Lilly公司问世,吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品,迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场,产生了巨大的社会效益和经济效益。,基因工程技术可生产的药物和制剂包括:(1)免疫性蛋白:如各种抗原和单克隆抗体;(2)细胞因子:如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子;(3)激素:如胰岛素、生长激素、心素纳;(4)酶类:如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤
2、维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。,主要基因工程产品的研制、开发、上市时间,美国已批准了56种生物制剂部分摘录(1),产品 公司 主要适应症-人胰岛素Eil Lilly 糖尿病人生长激素 Eil Lilly 儿童生长激素缺乏症&2a干扰素 Hoffmann-La Rocke 白血病a-2b干扰素 Schering-Plough 白血病、爱滋病、肝炎小鼠抗CO3单抗Ortho Biotech 肾、心移植排斥反应乙肝疫苗MSDMerck 乙型肝炎t-pA(altepl-ase)Genentech 急性心肌梗死、肺栓塞B型嗜血性流感疫苗 Praxis
3、Biologics B型嗜血性流感,美国已批准了56种生物制剂部分摘录(2),产品 公司 主要适应症-EPO Ortho Biotech慢性肾衰竭贫血a-n3干扰素Interferon Sciences 性疣r-1b干扰素Genentech 类风湿rG-CSFAmgen 化疗所致的白细胞减少GM-CSFImmunex 自体骨髓移植白细胞介素-2Chiron 转移性肾癌凝血因子VII Genetics Institute 血友病,美国已批准了56种生物制剂部分摘录(3),产品 公司 主要适应症-1b干扰素 Berlex Lab Chiron 多发性硬皮病-葡萄糖苷脂酸Genzyme Gauche
4、r遗传病单抗治疗剂 Centocor 抗血液凝固因子VIIINovo 血友病HumalogLilly 糖尿病Nateplase三井-持田 溶血栓alfacon-1干扰素Amgen 慢性丙肝干扰素8-nlOtsuka(日本)治疗蕈样真菌病,1989年,我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物重组人干扰素lb,标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。重组人干扰素lb是世界上第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物,也是我国自主研制成功的拥有自主知识产权的基因工程一类新药。截至2001年底,一共批准了21种基因工程药物和疫苗,其中3种是拥有自主知识产权的一类新药,即 a-1b干扰素、重组牛碱
5、性成纤维细胞生长因子和重组链激酶。世界上销售额排名居前10位的基因工程药物和疫苗,中国已能生产6种。,我国2001年前批准的基因工程药物,2006年4月前我国批准上市的35种生物技术药物,我国目前能够生产的生物制剂(1),(1)干扰素a-1b(2)干扰素a-2a(3)干扰素a-2b(4)r干扰素(5)白介素-2(6)粒细胞集落刺激生长因子G-CSF(7)粒细胞-巨噬细胞集落刺激生长因子GM-CSF,我国目前能够生产的生物制剂(2),(8)链激酶(9)促红细胞生成素EPO(10)碱性成纤维细胞生长因子bFGF(11)人生长激素GH(12)人胰岛素(13)乙肝疫苗(14)痢疾疫苗进入I期、II期临
6、床:t-PA(组织纤溶酶原激活剂),白细胞介素-3,重组人胰岛素,尿激酶等,我国基因工程药物研究和开发:起步较晚,基础较差。1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果,于1997年 通过 期临床,并获得国家一类新药证书,成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市,在研究开发中的也有10余种。,囊性纤维变性是一种遗传病,患者体内会产生粘稠的粘液,阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道,大约有一半的患者活不过31岁。英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊,羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。向德国一
7、家药厂出售一头这样的转基因羊,获得50万英镑。,胰岛素,1000 磅牛胰 10 克胰岛素,200 升发酵液 10 克胰岛素,干扰素,1200 升人血 1 升发酵液,23 万美元/病人 200300 美元/病人,基因工程(genetic engineering):也称基因操作、遗传工程,重组体DNA技术,基因克隆或分子克隆,指将不同生物的遗传物质基因,在体外进行剪切、组合和拼接,使遗传物质重新组合,然后通过载体(质粒、噬菌体或病毒等)转入微生物、植物或动物细胞内,进行无性繁殖,并使所需要的基因在细胞中表达,产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。,供体细胞,载体分子,外源DNA,外源基因,分
8、离,酶切,酶切,连接,转化扩增,DNA重组分子,受体细胞,鉴定与表达,重组转化子,工程菌或细胞蛋白产物,工程菌或细胞培养,重组产物分离纯化,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,基因工程的操作流程,1、分:分离目的基因2、切:对目的基因和载体适当切割3、接:目的基因与载体连接4、转:重组DNA转入受体细胞5、筛:筛选出含有重组体的受体细胞6、表:目的基因在受体细胞中表达,受体细胞成长为基因改造生物,基因工程制药的基本过程,获得目的基因构建重组质粒组建基因工程细胞工程菌培养产物分离纯化,目的基因的获得,一、酶切法直接分离目的基因二、PCR直接扩增目的基因三、文库法分离
9、目的基因四、化学合成目的基因,酶切法直接分离目的基因,gagctc,aagctt,限制性内切酶在DNA克隆中的应用,PCR,Polymerase chain reaction聚合酶链式反应,PCR的基本原理,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,55,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程
10、PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR 动画,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,引 物 退 火,DNA 复制,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4 小时,片段化、分级分离,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,化学合成目的基因,什么是载体?,载体(Vector):将外源目的DNA导入受体细胞,并能自我复制和增殖的工具。,载体概述,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker
11、,基因载体,载体概述,三个显著特点:(1)分子量更小,仅为2.7KB,容纳外源DNA量增大;具有更高的拷贝数(每个细胞含500-700个拷贝)。(2)含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因Lac Z,可利用-互补原理进行蓝白斑筛选。(3)多克隆位点区(MCS)由人工合成的多个单一酶切位点构成。,质粒载体,连接,转化受体细胞,1、抗药性检测筛选法,2、显色检测,IPTG:异丙基硫代半乳糖苷 诱导物X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷,3、限制酶切图谱检测,4、PCR扩增检测,用PCR的方法检测是否插入外源基因片段。优点:不需要合适的酶切位点。缺点:假阳性高。,5、原位杂交检测,根据插
12、入DNA片段的序列设计并合成探针,以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据,6、序列测定双脱氧测序,双脱氧末端终止测序法的基本反应:GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,双脱氧末端终止测序法,Sanger双脱氧终止法测序过程,模板序列,测序读片,近年来,建立了一种使用荧光染料的无放射性标记的DNA测序法。它使用4种不同颜色的荧光染料分别标记4种不同的碱基,并在一个凝胶电泳的泳道中进行电泳,然后通过激光作用诱发荧光,达到检测碱基的目的。激光检测器把收集到的信息传到电脑,计算机会自动显示或打印出碱基顺序。这样一个泳道一次电泳可读出
13、450左右个碱基,一块凝胶36个泳道可测36450约16200个碱基,大大加快了测序的速度。后来又发明了一种用毛细管电泳代替凝胶电泳的方法,可大大加快电泳的速度分辨率,并可实现自动灌胶和自动进样。,测序结果,7、外源蛋白质检测,利用插入DNA所表达的蛋白质的功能或者结构性质,检测外源蛋白质的存在。适用于表达载体的检测。,受体细胞选择,外源基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌细胞中的表达外源基因在病毒中的表达外源基因在酵母细胞中的表达外源基因在昆虫细胞中的表达外源基因在植物细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达,1、大肠杆菌表达系统大肠杆菌属革兰氏阴性菌,它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原
14、核生物种类之一,也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。优点:繁殖迅速、培养简便,代谢易于控制。缺点:大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素,可导致人体热原反应。,2、枯草杆菌表达系统枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌,是一类革兰氏阳性菌。优点:枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因,能将具有表达的产物高效分泌到培养基中,大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等,而且在大多数情况下,真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。枯草杆菌不产生内毒素,无致病性,是一种安全的基因工程菌。枯草杆菌具有芽孢形成的能力,易于保存和培养。枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗
15、传学背景清楚等优点。应用:已成功的用于表达人的干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。,在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,形成被膜包裹或无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB)。如果未进行特殊设计(如分泌型表达或融合型表达),外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时,表达产物一般倾向于形成包涵体。因此,以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上,这种高表达率也是包涵体法的长处所在。在细菌细胞内,集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程,因
16、此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态,因此需要在体外进行人工变性(解除共价修饰和驱散集聚体)复性操作。,包涵体表达,融合型表达,将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起,并作为一个开放型阅读框架进行表达,由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中,通常受体细菌的蛋白部分位于N端,异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点,可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。,N末端:由原核基因编码一段多肽,C末端:是完整的真核外源基因。,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,常用的受体蛋白(原核细
17、菌表达的蛋白质),(D3)受体蛋白的切除方法,化学断裂法:溴化氰(CNBr)-Met-(切点)-AA酶促断裂法:凝血因子Xa,有蛋白酶活性,识别序列:IleGluGlyArg-(切点)-AA,分泌表达蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”:蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”:蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。,分泌蛋白表达的原理图示,常用的大肠杆菌信号肽,碱性磷酸酶信号肽(phoA)膜外周质蛋白质信号肽(OmpA)霍乱弧菌毒素B亚单位(CTXB)。,酵母表达系统,能提高重组异源蛋白产率的诱变酵母菌,基因工程细胞的扩大培养,(一)基因工程菌的稳定性(二)基因工程菌培养
18、的程序(三)基因工程菌的培养方式(四)影响基因工程菌培养的各种因素分析(五)基因工程菌的培养设备-生物反应器,1、基因工程菌质粒的不稳定性,基因工程菌质粒不稳定与2个因素有关:(1)分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。(2)结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失而导致工程菌性能的改变。由于丢失质粒的细菌要比含有质粒的工程菌更具有生长优质,因此在竞争中最后会取代工程菌,而演变成为优势菌。最后导致蛋白质表达量的减少。,2、质粒稳定性的分析方法,(1)将工程菌培养液样品适当稀释,均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基上,培养10-12小时,统计所长出的菌落数A;(2
19、)然后随机挑选100个菌落,接种到含有抗生素标记的平板培养基上,培养10-12小时,统计所长出的菌落数B;(3)计算出B/A的比值。该比值能够反映出质粒的稳定性。因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。,3、质粒不稳定的原因,1、分裂不稳定-是指基因工程菌在分裂的子代菌体中,出现一定比例不含质粒的现象。它主要与2个因素有关:(1)工程菌产生丢失质粒的概率,拷贝量低的工程细菌,它所产生不含质粒的细菌变异株和概率较大。(2)丢失质粒的细菌、含有质粒的工程菌之间的竞争力大小。2、结构不稳定-是指外源基因从质粒上丢失、或者发生碱基后果排、缺失现象,最终导致工程菌性能改变的现象。,
20、4、提高质粒稳定性的方法,(1)、分阶段培养法(2)、在培养基中加入抗生素,形成选择性压力(3)、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施,(1)、分阶段培养法,工程菌的培养一般分为2个阶段:(1)第一阶段-先使菌体生长至一定密度。(2)第二阶段-开始诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因没有表达,减少了丢失质粒的细菌的产生概率,也就增加了工程菌的稳定性。,(2)、培养基中加入抗生素,形成选择性压力,因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。所以可以通过加入抗生素来抑制质粒丢失的细菌的生长。,(3)、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施,通过以下方
21、法可以提高质粒的稳定性。(1)间歇送氧(2)改变稀释速率,(二)基因工程菌培养的程序,1、摇瓶操作-通过摇瓶操作,来子解工程菌生长的基础条件,如温度值、培养基的组分、氮碳比、表达产物的积累对于工程细胞的影响。2、培养罐操作-通过培养罐操作,来确定培养参数、确定培养方案、以及确定培养顺序。,(三)基因工程菌的培养方式,1、补料分批培养2、连续培养3、透析培养4、固定化培养5、高密度培养,1、补料分批培养,是指将种子接入发酵反应器进行培养,经过一段时间之后,间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的方法。其目的是为了创造一个良好的微生物环境,延长菌体的对数生长期,来获得高密度的菌体总量
22、。,2、连续培养,将种子接入发酵反应器中,搅拌式培养达到一定的菌体浓度之后,同时进行进料、出料的操作,通过控制一定的营养物稀释比率,来进行不间断式培养的方式,称为连续培养。连续培养有利于保持生产环境的恒定,有利于控制菌体的生长速率。但是由于基因工程菌的不稳定性,导致连续培养比较困难。,3、透析培养,透析培养是利用膜的半透性原理,使得代谢产物和培养基分开,通过去除培养液中的借调产物的方法来消除代谢产物对工程菌的不良影响。透析装置是用半透膜将发酵器隔成二半,形成发酵液区、和透析液区,通过透析来及时移去合成产物。半透膜的种类、孔径、面积、发酵液和透析液的比例、透析液的组成、循环流速、培养持续时间等等
23、因素会影响产物的得率。用透析法培养大肠杆菌E.coliHB101(pPKAS2)生产青霉素酰化霉,其产率可以提高11倍。,4、固定化培养,为了维持质粒的稳定性,人们将固定化技术和基因工程菌结合起来,进行固定化式连续培养,有利于提高生产效率。,高密度培养技术,又称高密度发酵技术,指提高基因工程菌菌体的发酵密度,最终提高产物的比生产率,即单位体积单位时间内产物的产量。优点:不仅可以减少培养体积、强化下游分离提纯,而且可以缩短生产周期,减少设备投资,从而降低生产成本。,大肠杆菌高密度培养技术,大肠杆菌高密度发酵理论最大值为400g DCW/L(DCW:dry cell weight),相对于发酵液中
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