[生物学]海洋种质资源的保存.ppt

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1、第九章 种质资源的保存,（1）概论（2）掌握大型藻类的纯种保存方法（3）掌握海洋微型生物的冷冻保存方法（4）了解海洋动物生殖细胞的冷冻研究现状，并掌握其保存方法,目 录,大型藻类纯种保存方法海洋动物生殖细胞的冷冻保存海洋微型生物的冷冻保存,概 念,种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。种质资源保存是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中所包含的遗传物质保持其遗传完整性和活力，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。,存在问题分析,遗传背景清楚的纯系实验生物尚未开发出来。之所以如此，海洋生物在放在人工管理条件下，进行饲育和繁殖困难程度大、经济成本高和保存难度大造成的。海洋

2、生物学领域，实验材料始终依赖天然生物，纯系实验生物仍未确立，如果作为实验材料，难以保证实验数据的重复性。,低温生物学,自从1949年Ploge，Smith和Parkes发现甘油在细胞低温保存中有抗冻作用后，对生物细胞和组织的低温冷冻保存研究迅速展开，并形成了一门新兴的学科 低温生物学。低温生物学主要是研究在低温(一般0-196)条件下生物的形态结构、生理生化等生命现象的变化规律；以及对细胞、组织、器官乃至整个生物体活性保存的一门边缘学科。发展此项技术的意义在于克服时间和空间的条件限制进行人工繁殖，并且为品系纯化及遗传基因多样性保护提供技术支持。,海洋植物的冷冻保存,一、大型海藻种质保存,海洋藻

3、类的保存工作起始于20世纪初期对海洋微藻的保护，国际著名的海洋微藻保存机构CCAP、SAG、UTEX、COBRA等主要进行海洋微藻种质资源的保存，其种质保存的数量超过了2000多种，种质收集范围也从早期的区域性海藻种类发展到世界范围内海藻种质采集工作。上述国际海藻种质资源保存主要以微型藻类为主，很少有关大型海藻种质保存的报道，种质保存的方式以细胞继代培养为主，仅CCAP报道了超低温保存。,中国已经发展和建立了一系列大型海藻种质资源保存技术，收集和保存了大量具有生产应用价值的海藻遗传资源，为大型海藻的种质保存做出了较为突出的贡献。目前，已经建立低温弱光保存技术、固体保存技术、组织(愈伤)培养、单

4、倍体克隆和超低温保存技术，实现了包括海带、紫菜、裙带菜的种质资源库建设。,大型海藻种质冷冻保存的方法,目前大型海藻种质保存技术按照保存温度可分两大类：传统的低温弱光保存(一般为8-12)和以低温(4)、冷冻(-40)、低温真空冷冻干燥和超低温(-196)为主的冷冻保存。,低 温 弱 光 保 存,传统的低温弱光保存是目前较常用的一种大型海藻种质保存的方法，该方法是在适宜的光照、温度条件下，利用液体培养基保存海藻细胞。低温弱光条件下海藻细胞的代谢水平较低，能够在一定程度上实现海藻种质的长期保存。现在海带、紫菜和裙带菜等大型藻的种质保存一般采用这种方法。,海 带 配 子 体,海带配子体是一种以有丝分

5、裂方式进行细胞增殖的微小藻体，并可通过两性生殖或单性生殖发育成大型叶状体。目前，海带种质资源保存技术主要是海带配子体的低温弱光保存，通过低温(4)和弱光12 Emol(cm2.s)来抑制海带配子体克隆细胞的生长和发育，使其进行缓慢的有丝分裂，以达到长期保存的目的，利用该技术保存的海带配子体及配子体克隆最长已达26a的时间(1978年保存的“无性繁殖系1号”)。,冷 冻 保 存,生物材料之所以在低温下能够长期保存，是因为低温能抑制生物细胞的生化活动，尤其在超低温条件下，细胞的整个代谢活动等都几乎完全停止，可排除遗传性状的变异，同时保存细胞活力。因此该方法能有效解决海藻种质保存中的污染、混杂和变异

6、问题，有望实现藻类种质的长期保存。目前用于大型海藻低温冷冻保存的方法主要有以下几种。,低 温 保 存,4的低温能够在一定程度上抑制生物细胞的生化活动、保持生物细胞活力，是一种常见的海藻种质保存方法。,冷 冻 保 存,-40低温能够抑制生物细胞的生化活动、可排除遗传性状的变异，可用于多数海藻种质保存，对于冷敏感的海藻细胞除外。,低温真空冷冻干燥法,1967年Holm-Hansen用该法成功保存了2种蓝绿藻和4种绿藻。低温真空干燥技术的基本方法是先将生物材料低温冻结，然后用真空技术将物料中的水分抽干，使之干燥。,超 低 温 保 存,超低温保存是指在低共熔点(约为-135-139)以下的温度保存材料

7、，通常采用液态氮作冷媒。超低温保存能够长期保持生物遗传稳定性，是目前保存活体生物材料最为有效的方法。超低温保存藻类的研究开始于20世纪60年代，之后的20年里主要对各种淡水、海洋微藻的保存进行了较为深入的研究，但很少有关于保存大型海藻的报道。直到进入20世纪80年代才对大型海藻的超低温保存给予了更多关注，采用的方法主要以两步法为主，近年来又发展了胶囊化-脱水法和玻璃化法，并开始应用于大型藻类的冷冻保存。,一 步 法,一步法对早期的冷冻保存方法进行改进，在生物材料中加入甘油或DMSO(二甲基亚砜)后再投入液氮中保存。但是，一步法对含水量较高的海藻细胞一般不太适合，只适用于少数藻类的保存。,两 步

8、 法,该方法的第一步是在保存材料中加入抗冻保护剂，然后对材料进行预冻。第二步是将预冻过的材料投入液氮中快速冷冻。Morris等较早采用两步冷冻法成功地保存了多种藻类。大量研究结果表明，两步法适用于多种微藻及部分大型藻类的保存，目前已成为藻类种质超低温保存最为传统的方法。两步法的缺点主要是在预冻过程中要严格控制降温速率和停留时间，同时要求特殊的设备和技术，而且使用的抗冻保护剂对生物材料有害。,包埋脱水法,包埋脱水冷保存技术于20世纪90年代初建立，该法运用了细胞固定化方法的原理，将生物材料包埋在褐藻胶基质中，使其胶囊化(固定化)，适度脱水后再进行超低温保存。近年来已将该方法用于几种大型藻类的保存

9、，并获得初步成功。该技术操作简单，不需要复杂设备，不使用抗冻保护剂，是对超低温保存技术的一个重大改进，目前需要解决的关键技术是预培养条件、脱水速率和胶球含水量。,玻 璃 化 法,近十几年来，应用该技术已经成功地保存了100余种植物材料，包括植物茎尖、原生质体、分生组织、合子胚、细胞等。通过借鉴高等植物玻璃化冻存的经验和方法，相信玻璃化法在对大型藻类种质进行超低温保存方面会有很大的应用潜力。采用该方法保存藻类种质已有成功报道。为了提高保存效果，可以将玻璃化法和包埋法结合使用，该方法集包埋法和玻璃化法的优点于一身，操作简便，可以对大量材料进行处理，而且与包埋法相比，复温后材料再生较早，存活率较高。

10、虽然目前还没有应用该方法保存大型海藻的报道，但该方法为大型海藻种质保存提供了新的思路。,结 论,遗传稳定性是海藻种质保存中最为关键的问题，是选择保存方法、确定保存条件的最重要指标，是判断种质保存技术可行性的重要依据。虽然4的低温保存和-40的冷库保存都能够有效地保存生物材料，且设备简单、经济实用，也能在一定程度上保持种质遗传稳定性，但是在以上用于海藻种质长期保存的方法中，超低温保存无疑是长久保持海藻种质遗传稳定性的最好方法。,大型藻种质超低温保存的原理,超低温保存一般以液氮作为冷源，又称液氮(LN-196)保存，理论上讲，超低温保存可以大大减慢，甚至终止细胞代谢和衰老过程，能够最大限度地抑制生

11、理代谢强度，保持生物材料遗传稳定性，从而达到长期保存种质的目的。,对大型海藻种质保存基于曾呈奎等在20世纪70年代的的研究，他们通过海藻单倍体的细胞培养探明了海带、紫菜等大型海藻的生活史，并成功分离培养出海藻的雌雄配子体、果孢子、游孢子和丝状体。因此保存海带、紫菜等大型海藻的单倍体在育种中很有价值，可以用作育种材料，也可以用来研究杂种优势。,据统计，国际上已对2000多种株的藻类进行过冷冻保存的研究，这些研究为大型海藻超低温保存提供了有力的理论基础。近年来超低温保存方法的发展已经达到一个新阶段，随着一些新的技术开始用于超低温保存技术的研究中，如天然抗冻保护剂-抗冻蛋白的使用，低温生物显微镜的应

12、用以及玻璃化、包埋脱水法等新的冷冻方法的发展和建立，大型海藻的超低温保存将会有更广阔的前景。,影响超低温保存存活率的因素,实验材料本身的抗冻性对存活率有重大的影响。超低温保存操作过程中的每一步失误都可能对细胞造成致死性的伤害，藻类细胞与高等植物相比，含水量、液泡化程度高，在超低温保存中，更易受到细胞内形成冰晶的伤害。因此，优化冷冻保存程序是提高海藻存活率的一个重要途径。,海藻自身的抗冻性,海藻的种类和株系 海藻的种类和株系差异是决定存活率高低的重要因素。Morris对不同种、株的小球藻的冷冻保存实验表明，他们的抗冻性差异极大，所以藻的种类和株系差异可能是影响某些藻类存活率的重要因素。,海 藻

13、细 胞,Morris的研究表明一般处于静止期的细胞对冻害的敏感性要低于指数期细胞。Benhra在冷冻保存栅藻时却得到了相反的结果。而Ben-Amotz对12种藻冷冻保存后观察到细胞年龄与抗冻性无关。因此，细胞年龄对抗冻性的影响可能与细胞的种类有密切关系，不同的材料应选用不同年龄的细胞。,培 养 条 件,预培养 可以通过选择适宜的预培养条件提高藻类的抗冻性。某些营养盐的缺乏和营养方式的改变都可以增加抗冻性。已有实验证明，碳酸氢钠和磷酸盐的限制均诱导出了较大的抗冻性。此外，光强、光周期等培养条件也可显著影响藻类生长发育状态和抗冻性。,零上低温驯化,Ben-Amotz等研究表明，采用零上低温对藻类进

14、行冷驯化是提高其抗冻性的一个重要途径。,冷冻保存程序(两步法和包埋法),两步法1 冷冻操作前材料的处理两步法主要依据海藻的种类选择合适的抗冻保护剂，主要使用二甲基亚砜(DMSO)、甘油和甲醇3种保护剂，其中DMSO的使用最为普遍，而在某些藻类的保存中，采用复合保护剂的保护效果往往优于单一保护剂。另外，保护剂使用浓度对海藻存活率有很大影响，常用浓度范围为515。上述几种渗透性保护剂通常在室温下加入，一般需要处理560 min。多数保护剂对细胞有一定的毒性，毒性大小与使用浓度及处理时间相关。因此，进行保护剂毒性预实验，有助于确定保护剂的最佳使用浓度和处理时间。此外，在冷冻操作前对材料进行适度脱水或

15、降低保存液中的盐浓度都已证明可提高存活率。,所使用的冷冻保护剂应具有以下特性：分子质量较小 易于与溶剂混合 快速渗入细胞 无毒或毒性小 易洗脱 常用的是DMSO。,冷冻保护剂的作用：降低冰点，促进过冷却和“玻璃化”状态形成提高溶液黏滞性，阻止冰晶形成增加细胞膜透性，加速胞内水分向外渗出稳定细胞内大分子正常结构，阻止低温对膜的伤害,2 冷冻操作,主要涉及预冻过程中降温速率、预冻终点和终点温度上的停留时间。若降温过快则会引起胞内冰的形成(intraceller ice damage)，对大多数藻类来说，采用较慢的降温速率(0.54min)。但如果降温速率过慢或预冻时间过长，细胞则可能因过度脱水而导

16、致膜损伤和(或)因高盐浓度而造成溶质损伤(solute damage)，或称溶液损伤(solution damage)。因此应选择一个最佳的冷冻速率。除此之外，还应选择合适的预冻终点及在终点温度上的停留时间。在藻类冷冻保存中，预冻温度通常为-30-60，停留时间一般为060 min。材料经过预冻后需要快速转移到液氮中，通常是将装有实验材料的冻存管或细塑料管迅速放入液氮中。采用后者可获得更快的降温速率。此外，冷冻过程中藻的密度也是影响存活率的重要因素。,3 化冻操作,不同的化冻操作对存活率有很大影响。一般采用快速化冻法，即将保存材料迅速移入25-40水浴中快速振荡，直至最后一粒冰晶消失。快速化冻

17、法可阻止化冻过程中细胞内冰晶的形成，有关慢速化冻对冷冻保存的影响研究较少。,4 化冻后的材料处理,材料化冻后要尽快去除抗冻保护剂，目前对保护剂去除方法的研究相对较少，通常采用稀释或先稀释后离心的方法，稀释温度和稀释速率都会显著影响存活率。经处理的材料通常要经过一段时间的“恢复”后方可用于存活率的鉴定，研究表明，化冻后材料的再培养条件(光、温和培养液浓度等及存活率的鉴定方法都会对存活率产生较大影响。,包 埋 法,1 冷冻操作前材料的处理首先要对材料进行蔗糖预培养。蔗糖不仅能在脱水过程中稳定细胞膜和蛋白质，还能促进细胞基质的玻璃化，从而提高耐冻性。包埋法的关键在于所用蔗糖浓度及处理时间。另外，在高

18、浓度蔗糖预处理时加入其他保护剂也有助于提高存活率。藻类实验表明，蔗糖预培养是必要的，且宜采用比高等植物较低的蔗糖浓度和较短的培养时间。,2 冷 冻 操 作,主要是确定适宜的脱水速率与脱水后胶球含水量。最适脱水速率与植物种类有关。Morris指出每一种藻都有其适宜的脱水速率以达到冷冻后的最大存活率，Hirata研究发现脱水和投入液氮保存之后的存活率受平均脱水速率的影响。藻类材料的实验结果表明，大型海藻材料脱水速率宜高于微藻的脱水速率。胶球含水量是影响包埋脱水法冷冻保存存活率的另一个重要因素。已报道的几种藻类的最适含水量一般为40，但也有例外。,3 化 冻 操 作,王起华等的研究表明加快化冻速度可

19、显著提高裙带菜配子体克隆的冷冻保存存活率，而且将胶球直接放入溶液中化冻比胶球保留在冻存管中化冻获得更高的化冻速率，由此可以显著地提高存活率。,超低温保存后存活率的鉴定,鉴定存活率是超低温保存操作中的重要环节。目前主要采用下列两大类方法：3.1 细胞(或组织器官)的形态和生理活 性的鉴定3.2 细胞(或组织器官)再生能力的鉴定,细胞的形态和生理活性的鉴定,已采用的方法有细胞染色法或直接显微镜检法；细胞运动能力测定法；光合放氧活性测定法；叶绿素含量测定法；琼脂平板海藻细胞克隆图像分析；细胞分子和生化稳定性测定法等。这些方法大多可在材料化冻并经过短期恢复之后进行，具有快速简便的优点，但是可靠度通常较

20、低。,细胞再生能力的鉴定,目前，鉴定大型藻类存活率的主要方法是组织、器官再生法。该方法在材料经过长时间的再培养后进行，比较费事、费时，但可靠度较高。,目前由于不同测定方法的可靠性存在很大差异，给评估保存方法的优劣带来很大困难，这是一个值得重视的问题。藻类长期冷冻保存中所应该达到的最低存活率指标尚无共识，但CCAP采用50的存活率作为标准。,意义和展望,研究大型海藻的种质保存具有重要的意义。首先，大型海藻具有重要的经济价值，在食品、医药、工业、和农业等领域都具有广泛的应用。有些海藻(海带、石莼、和昆布等)具有丰富的营养价值和良好的药用价值；褐藻中含有的褐藻胶、碘和甘露醇，红藻中含有的琼胶和卡拉胶

21、等，都是工业领域的主要原料；海藻还可以作为农业有机肥料和牲畜的饲料。同时大型海藻也具有重要的生态保护价值，它们是海区重要的初级生产者，维持了海水中氧气、二氧化碳的循环，使他们始终处于平衡状态，可以对营养化海水养殖区进行生物修复。,目前，在生产实践中普遍运用的传统保种方法存在许多弊端。人工养殖的大型海藻在海上保种时往往因自然杂交而引起品种退化，或由于病毒、病菌的侵染而失去良种的价值，从而影响了海藻养殖业的健康持续发展。因此，如何保护好大型海藻的优良种质成为目前需要重点解决的问题。大型海藻的超低温保存，从理论上讲可以为低温生物学领域提供新的资料，从实践上讲可以有效地解决藻类种质保存中的污染、混杂和

22、变异等问题，有望实现藻类种质的永久保存，对藻类养殖和发展具有重要意义。,意义和展望,意义和展望,经过30多年的探索和研究，大型海藻的种质超低温保存工作已经取得了一定的进展，并且已经把分子生物学手段应用于紫菜和裙带菜等的种质鉴定中。但现阶段的大型海藻的种质超低温保存仍存在一定缺陷：超低温保存的条件一般是建立在经验的基础上，没有一套标准的方法，导致较大的实验风险和人力物力浪费；对低温条件要求较高，增加保存成本。因此，降低实验成本和提高种质存活率是目前亟待解决的问题。,典型经济褐藻种质资源保藏中心中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传育种研究室,典型经济褐藻种质资源库（TCCP）建制于1975年，是海

23、洋生物遗传育种研究室历史较为悠久的研究平台，主要进行海带、裙带菜等典型物种种质资源的收集、保存与研究工作。TCCP经过30多年的发展，总建筑面积达到100平方米，现建有三个低温保藏库，其容量可保存种质6000份，保藏设施为自动化程序控制，在整体设计方面处于国际先进水平。目前已收集和保存的褐藻种质资源包括海带属8个物种300余个种系、裙带菜属1个物种60余个种系的种质资源，是国际上最大的大型海藻种质保藏机构。根据分类学研究以及文献报道，典型经济褐藻种质资源库（CCTP）所收集的海带种质资源占全世界海带属的25%，占我国现有海带种群遗传资源的80%以上。,海洋动物生殖细胞的冷冻保存,养殖种类种质退

24、化的原因分析,1海洋环境污染日趋严重。2捕捞设施先进，捕捞强度过大。3过度的人工放流增殖作业。4养殖过程中的逃逸问题。5养殖业自身污染日益严重。6有效繁育群体规模过小，造成近亲繁殖。7升温促熟、提早产卵的危害巨大。8单一种类高密度养殖模式存在弊病。9滥用抗生素药物，后果极其严重。,随着渔业生产的快速发展，有许多水产动物种质已出现退化、混杂现象。如鲢、鳙、青鱼、草鱼因多代人工繁殖，种质出现退化；不同水系中华绒螫蟹混合养殖、繁殖，使许多地方群体尤其是人工繁殖群体种质已混杂；白暨豚、鲥鱼、白鲟等频危灭绝，种质资源正逐渐消失。,主要养殖种类在繁育过程中因长期近亲交配、逆向选择，加之养殖环境恶化等原因，

25、出现了生长缓慢、肉质变劣、抗病力下降以及性成熟提早等种质退化的现象。若以海水养殖种类为例，如海湾扇贝，因其种质的退化，致使抗病力减弱生长速度、肥满度、贝柱规格、产量和经济效益均严重下降；又如养殖大黄鱼已普遍出现了生长缓慢，表型性状变差，性成熟低龄化，品质下降等种质退化现象。,水产养殖存在问题,海水养殖和人工放流的健康发展均离不开充足、优质的苗种来源。但是由于自然资源减少，很多野生鱼种的亲鱼很难采捕到。加之人工育苗的局限性，很难避免近亲交配和小群体繁殖所产生的基因丢失和遗传嬗变，导致了野生种群的遗传多样性下降和种质的退化。,措 施,黄渤海中国对虾野生种群、种质因开发过度而衰败，短期内难以恢复。因

26、此，国家划定保护区对中国对虾种质资源进行有效保护。,水产动物种质资源保护既包括已知种质或遗传物质的保护，也包括一些遗传潜力材料的保护。保护目的是尽最大可能维持种内遗传变异水平，维持物种进化潜力，维持物种和种群的自然繁殖力和自然繁殖场所，促进资源可持续利用。保护层次包括群落、物种、亚种(群体)、家系、个体、器官、组织、细胞、亚细胞(细胞质、染色体、基因片段)等。保护策略和措施主要是就地保护和异地保护两方面。,就 地 保 护,就地保护是指在生物繁殖、生长、进化的原栖息地，对生态系统和栖息环境进行保护，达到保护生物的群体、群落目的，这是一种群体水平的遗传保护，是一种动态型遗传保护。就地保护时被保对象

27、与栖息地环境协同发展、进化，能维持群体一定大小，提供精卵、幼体、成体、繁殖亲体等各种规格材料，同时人们也可以随时观察研究被保护群体的遗传变化和生态变化。,Jack EWilliams et al(1989)研究北美濒危鱼类保护措施时提出两点：(1)保护好生态系统、群落、种群；(2)建立监测系统，提供鱼群和水生生物将来变化的基本数据，不仅能对个别种类是否可以恢复作出评估，也能对生态系统的健康状况作出评价。,异 地 保 护,异地保护指在物种(种群)原栖息地以外的人工环境下，对生物多样性的某种成份(如群体、家系、个体、器官组织、细菌亚细胞等)予以保护和保存。这是个体水平或细胞水平的遗传保护。如山东青

28、岛、江苏南京罗非鱼良种场，广东肇庆鲮鱼原种场。,保护好野生大黄鱼群体的种质资源，就可以通过定期更换大黄鱼亲本(即采捕野生亲鱼来培育苗种)和必要的提纯、复壮工作来恢复大黄鱼的经济性状。,我国政府已制定水污染防治法、海洋环境保护法和中华人民共和国渔业法，在近海划定禁渔区和禁渔期，在非禁渔区和禁渔期规定了捕捞方法、渔具和网具，严禁危害资源的渔具和捕捞方法，实行捕捞许可证制度等一系列法规和措施这对保护和改善近海水域的生态环境，恢复自然群体的种质资源无疑将有很大的促进作用。,海洋动物生殖细胞的冷冻保存,以鱼类、海胆和鲍鱼等为代表的海洋动物的生殖细胞的冷冻保存。近年来，随着这些具有重要经济价值的鱼类和贝类

29、被人工养殖。海洋动物的精子和卵保存非常必要，所以生殖细胞的保存越来越受到重视。,海洋微型生物的冷冻保存方法,纯种保存的研究现状（一）,纯种保存的研究现状（二）,液氮超低温冻结保藏,1.冻存管的准备进口2.0 ml已灭菌内螺旋冻存管。型号：Corning 2028,Corning公司。2.保护剂的准备分析纯甘油加纯水配制成20%浓度，灭菌。3.微生物保藏物的准备微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。菌种的准备可采用下列两种方法：1）刮取培养物平板上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；2）接种液体培养基，振荡培养后将菌悬液离心，去上清，将菌体与保护剂混合分装于冻存

30、管内。每个冻存管的分装量为1ml。冻存管的标记为管外标记，用专用的非水溶性记号笔标记菌种保藏编号与保藏日期。注意：分装与标记时要多次核对该菌种与所分装管的标记是否正确无误。,液氮超低温冻结保藏,4.预冻使用分段降温法：将分装后的菌种管先放4C冰箱，半小时后放-20冰箱中2小时，然后放80C冰箱2小时以上，取出后放入液氮罐中快速冷冻。对耐低温的微生物可以直接放入气相或液相氮中。5.保藏 将塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150，液相中温度为-196。6.保藏周期一般10年以上。7.复苏方法从液氮罐中取出冻存管，立即放置在38-40水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，

31、一般约需50秒-100秒。开启冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。8.适用范围各类微生物。,液氮超低温冻结保藏,9.液氮保藏应注意事项 防止冻伤，操作注意安全，带面罩及防冻手套；塑料冻存管一定要拧紧螺帽；运送液氮时一定要用专用特制的容器，绝不可用密闭容器存放或运输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮；注意存放液氮容器的室内通风，防止过量氮气使人窒息；防止塑料冻存管破裂爆炸，如液氮渗入管内，当从液氮容器取出时，液态氮体积膨胀约680倍，爆炸力很大，应特别小心；注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期补充液氮。10.质量检查保存一段时间后抽取12支冻存管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、

32、杂菌污染等。,-80冰箱冻结保藏1.冻存管的准备采用国产2.0 ml冻存管（江苏海门产），使用前需灭菌。2.保护剂的准备同液氮保藏法。3.微生物保藏物的准备同液氮保藏法4.冻结保藏预冻同液氮保藏法，最后放-80冰箱中保藏。5.保藏周期一般40年左右。6.复苏方法同液氮保藏法。7.适用范围 各类微生物。8.质量检查 同液氮保藏法。,真空冷冻干燥保藏,1.冷冻干燥管的制备1.安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、装入标有保藏编号和保藏时间的标签（硫酸纸打印，大小1cm3cm左右），纱布和纸包扎，121下加压灭菌20分钟，备用

33、。2.保护剂的准备 12%的脱脂乳（BD公司DifcoTM Skim Milk）1ml分装于2ml离心管中，121下加压灭菌15分钟，4冰箱冷藏备用。3.冻干样品的准备 在最适宜的培养条件下将待保藏的微生物培养至静止期或成熟期，若是液体培养需离心除去培养基；若是固体培养，以接种环刮取菌体（或用棉签刮取）与保护剂混合均匀，分装。培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜。用较长的毛细滴管，滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1毫升。分装安瓿管，时间尽量要短，分装后立即预冻。还应注意多次核对菌种与各分装管的编号与名称是否相符。,真空冷冻干燥保藏,4.预冻 先放4冰箱

34、，半小时后放-20冰箱。一般预冻2小时以上。5.冷冻干燥将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；真空度接近空载时的最高值；样品温度与管外温度接近；选用1-2支对照管，内装蒸馏水，其水份装量与菌悬液同量，当水分完全升华后，可视为干燥完结；选用一个安瓿管，装1-2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结。冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。6.真空封口及真空检验真空显示0.021mPa以下，在真空条件下将安瓿管腰部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度.7.

35、保藏安瓿管装入专用塑料袋，按保藏编号顺序排列，4冷柜避光保存。,真空冷冻干燥保藏,8.冷冻干燥法适用范围大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母菌等的保藏，不适用于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。9.保藏周期不同微生物的保藏周期不同，一般在10年左右。10.复苏方法 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。11.质量检查冷冻干燥后抽取12支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。,中国

36、典型培养物保藏中心,(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)于1985年由国家知识产权局（原中国专利局）指定、经教育部（原国家教委）批准建立的专利微生物保藏机构，受理国内外用于专利程序的微生物保藏。CCTCC保藏的微生物包括细菌、放线菌、酵母菌、真菌、单细胞藻类、人和动物细胞系、转基因细胞、杂交瘤、原生动物，地衣，植物组织培养、植物种子、动植物病毒、噬菌体、质粒和基因文库等各类微生物（生物材料/菌种）。1987年CCTCC加入世界培养物保藏联盟(World Federation for Culture Collections,WFCC)

37、，经世界知识产权组织(WIPO)审核批准，自1995年7月1日起成为布达佩斯条约国际确认的微生物保藏单位(International Depository Authority,IDA)。,建议用下列方法恢复培养CGMCC冷冻干燥的菌种,、安瓶管开封1用浸过70酒精的脱脂棉擦净安瓿管。2用火焰将安瓿管顶端加热。3滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂。4用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。二、菌株恢复培养1用无菌吸管，吸取0.30.5ml适宜的液体培养基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。2取0.10.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。3若未能活化，或活化后有疑问时，请于收到菌种1个月内，通知保藏中心，经查证无误后，即免费补寄。三、注意事项1菌种活化前，请将安瓿管保存在6一10的环境下。2厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态。3某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长，此时请将步骤二(2）重复一次。,