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1、课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断,专题5 DNA和蛋白质技术,.DNA分子的结构,C、H、O、N、P,1.元素组成:,脱氧核苷酸,2.基本单位:,一.基础知识,脱氧核苷酸,脱氧核苷,磷酸,脱氧核糖,含氮碱基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T),一个核苷酸上的磷酸基团上的“OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水,形成磷酸二酯键,即在相邻的两个脱氧核苷酸的3和5碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3、5、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“OH”末端称为3端,而磷酸基团的末端称为5端,3.多脱氧
2、核苷酸链得形成,4.DNA分子的双螺旋结构,.DNA分子是由 的(即一条链为35,另一条链为53)脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。,.与 交替连结,排列在外侧,构成基本骨架;排列在链的内侧。,.两条链上的碱基通过 连结起来,形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律:即腺嘌呤一定与 配对,一定同胞嘧啶配对。,双螺旋,两条反向平行,脱氧核糖,磷酸,碱基,氢键,胸腺嘧啶,鸟嘌呤,.DNA的复制,2.时期,有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。,3.场所,细胞核(主要)、线粒体、叶绿体。,1.概念,由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。,4.基本条件,酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种
3、脱氧核苷酸模板:DNA的两条链,.边解旋边复制(过程),5.复制特点,.半保留复制(结果),6.遵循原则:,碱基互补配对原则,7.精确复制的原因,8.复制的意义,DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代,从而保持了遗传信息的连续性,规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板,碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行,总结:胞内DNA复制的基本体系,打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,.PCR(多聚酶链式反应),2.DNA聚合酶特性,不能从头合成DNA,只能从DNA的3端开始延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物。,
4、3.DNA聚合酶作用过程,当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链,DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,1.定义:是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。,4.PCR原理,.在80100C的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。,.当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。,.PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合,现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。,高温解决了打开双链的问题,但是,又
5、导致DNA聚合酶失活的问题,耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题,促成了PCR技术的自动化。,5.Taq DNA聚合酶的应用,6.需要为PCR反应提供的物质,缓冲液、DNA模板,分别与两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。,PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。,7.PCR技术的特点:,.PCR过程需要的引物不是RNA,而是人工合成的DNA单链,其长度通常为2030个脱氧核苷酸,8.细胞内复制和PCR不同点,.PCR过程
6、中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的,9.PCR的重要应用:广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。,1、PCR仪,.设备及用具,实质上一台能够自动调控温度的仪器。,二.PCR的实验操作,2、微量离心管,一种薄壁塑料管,总容积为0.5ml,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体,其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。,1.准备,2.移液,.实验操作步骤,按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。,用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。,混合后盖严微量离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁。,3.混合
7、,过程:将微量离心管放在离心机上,离心约10s。,4.离心,离心目的:使反应液体集中在离心管底部,提高反应效果。,将离心管放入PCR仪上,设置好PCR仪的循环程序。,5.反应,PCR一般经历三十多次循环,每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸.,.变性(模板DNA解旋),模板DNA经加热至940C。一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使成为单链,以便于它与引物结合,为下轮反应作准备。,PCR 循环第一步:高温变性,复性(退火),模板DNA经加热变性成单链后,温度降到550C,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合,延伸,温度升到720CDNA模板引物结合物在T
8、aqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料,以母链为模板,按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理,合成一条新的DNA链,PCR技术高度灵敏,为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验,PCR操作时要注意做到:,6.注意事项,隔离操作区,所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌;,分装试剂,使用一次性枪头,.理论上DNA扩增数目的计算,三.课题成果评价,1.一条DNA,复制n次,DNA为2n,2.a条DNA,复制n次,DNA为a2n,.实验中DNA含量的测定,1.原理,可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果,DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DN
9、A的含量有关。,2.过程,.稀释,2uLPCR反应液,加入98uL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释.,.对照调零,以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零。,取DNA稀释液100uL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值,.测定,.计算,DNA含量(g)50(260nm的读数)稀释倍数,50:1 g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02,光吸收,波长nm,260,240,220,280,0.1,0.2,比色杯,四.课题延伸,例如:PCR产物每轮循环增加一倍,30轮循环扩增量达230个拷贝(109拷贝),PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点,五.实验小结,PCR仪加热使()变性,复性使引物与模板DNA(),延伸需将反应温度升至中温(),在()的作用下,以()为原料,以()为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经()三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,模板,互补,Taq聚合酶,四种脱氧核苷酸,引物,变性、复性和延伸,72,
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