心肌缺血对大鼠肾皮质内NPRC表达的影响毕业论文.doc

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1、 本科生毕业论文（设计）开题报告书 生命科学 学院 生物科学 专业 2011 届学生姓名 论文（设计）题目心肌缺血对大鼠肾皮质内NPR-C表达的影响指导教师 专业职称所属教研室动物及人体科学系研究方向感觉与行为生理学课题论证：心肌缺血，是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。可能导致心肌急性暂时的或者持久性的缺血缺氧，心肌细胞代谢障碍，代谢产物堆积，损伤心肌，甚至造成心肌坏死，进而影响心脏功能，临床上表现为心绞痛，心肌梗死等临床综合征，甚至造成患者死亡。本研究拟运用Western Blot技术以探讨利钠肽受体的作用机制。本实验探究的预

2、期结果可为心肌缺血等心血管疾病的预防、临床治疗提供重要的基础资料，也为探索新的治疗手段提供思路。方案设计：首先查阅中英文文献，对本实验课题进行全面的了解，了解本领域的最新研究进展。制定详细的实验计划并依计划进行实验。并将实验结果整理成论文。进度计划：2011.3.6 到2011.3.16，查阅中英文相关文献，了解相关知识；2011.3.17到2011.3.24，查阅中英文相关文献，了解最新研究进展；2011.3.25到2011.5.9，依计划进行试验；2011.5.10到2011.5.25，将实验结果整理成论文。指导教师意见： 研究肾内利钠肽受体在心肌缺血后的表达变化规律，可为揭示肾脏利钠肽受

3、体在心血管疾病中的作用提供基础资料，具有一定的理论意义。实验设计合理，计划可行，同意开题。 指导教师签名： 年 月 日教研室意见： 教研室主任签名： 年 月 日本科生毕业论文（设计）文献综述利钠肽(Nat riartic peptide，NPs)包括ANP、BNP和CNP等，是近20年才发现的一类多肽。利钠肽是一类在体内主要起调节血容量、血压和心室肥厚的因子，在心脏的发育，高血压、心力衰竭的发生和维持中起重要作用。 到目前为止，在人体内共发现了3 种利钠肽，即心房利钠肽(at rial nat riuretic peptide，ANP)、脑利钠肽(brain nat riuretic pept

4、ide，BNP)、C 型利钠肽( C2typenat riuretic peptide，CNP)。成熟NPs含有两个半胱氨酸形成的二硫键,并由此形成17个氨基酸组成的环形结构，该结构是与受体的结合部位。但ANP和BNP的结构与CNP又稍有不同。在ANP和BNP结构的半胱氨酸后，分别接有5个和6个氨基酸组成的羧基端尾，而CNP终止密码子前的最后氨基酸是半胱氨酸，没有羧基端尾。不同物种之间ANP和CNP非常保守，而BNP结构变化则很大，例如人与猪的成熟ANP和CNP均分别有结构相似的22个和28个氨基酸，而人与猪的成熟BNP只有50%同源性，分别为32个和26个氨基酸。 NPs通过他们的受体起作用

5、。到目前为止，在哺乳动物体内共发现三种利钠肽受体 ( nat riuretic peptide receptor ,NPR)即NPR-A、NPR-B和 NPR-C，它们均是一次跨膜 ,以二聚体形式起作用。NPR-A和NPR-B属于鸟嘌呤环化酶受体，有三个结构域,即细胞外结构域、激酶同源结构域和鸟嘌呤环化酶结构域。NPR-A和NPR-B的细胞外结构域可与NP的环形结构结合。在细胞外结构域接受NP刺激后。鸟嘌呤环化酶结构域被激活，产生第二信使cGMP。激酶同源结构域与其他激酶(包括可溶性激酶和跨膜激酶)仅有30%同源性,但它具有80%的激酶保守氨基酸。激酶同源结构域具有调节细胞外结构域和激酶同源结

6、构域活性的功能，如果部分缺失该结构域，NPR要么失去结合利钠肽的活性，要么失去环化酶活性；如果完全缺失该结构域，NPR具有组成性鸟嘌呤环化酶活性，因而失去了对NPs的依赖性；该结构域还能与ATP结合,增强受体的鸟嘌呤环化酶活性。NPR-C只有两个结构域,即细胞外结构域和细胞内结构域，后者仅37个氨基酸。 NPR-C 的结构特点使其能够接受NPs刺激，但不能激活cGMP 途径。 NPR-C 受NP浓度调节，在利钠肽浓度过高时，NPR-C可结合多余的利钠肽，在机体需要时再慢慢释放。 NPs的功能在心血管系统中研究较多，许多因子可以促进心房和心室ANP和BNP的mRNA以及蛋白质的表达，如苯福林、肾

7、上腺素、异丙肾上腺素、低压低氧等。BNP通过打开 K+和 Ca2 +通道，刺激NO和cGMP产生，引起动脉血管舒张。CNP作用于附近血管平滑肌细胞，产生cGMP，再调节血管的扩张。NP还通过与NPR-C的结合减少第二信使 cAMP的产生，最终使环加氧酶表达减少,降低NO的合成，提高免疫力。类维生素A和二羟基维生素D3通过ANP和CNP调节cGMP促进骨的形成。 CNP还能促进二聚糖 (一种小的蛋白聚糖)表达，使造骨细胞钙质化。NPs对细胞分裂的调节有双重作用，低浓度NPs通过cGMP途径促进细胞增殖，高浓度NPs通过非cGMP途径抑制细胞增殖。三种NPs都能促进记忆，并且这种促进作用能被吲哚满

8、二酮抑制。由于NPs在利钠、扩张血管、提高免疫力、促进骨的发育以及神经调节等方面的重要作用，目前许多国家都开展了对利钠肽的研究，并已把它用于一些心血管疾病的临床诊断与治疗。ANP由De Bold于1981年首次发现并报道,主要在心房压力或张力升高时由心房肌细胞分泌。血管内皮素( Endothelin, ET)、血管紧张素II( Angiotensin II, Ang II )、抗利尿激素( Ant idiuretichormone, ADH)(儿茶酚胺、醛固酮、糖皮质激素、甲状腺激素等的浓度变化亦刺激ANP 的合成分泌)。ANP在CNS 的分布十分广泛。脑内有能合成、贮存和放 ANP 的神经细

9、胞及ANP受体。推测ANP作为一种神经递质或调质存在,可能还参与脊髓运动功能的调节。中枢ANP神经元通过下行通路直接作用肾脏调节尿钠和尿量。 BNP主要由心室肌合成,大部分通过冠状窦入血循环中。另外,肾上腺髓质也可合成和分BNP。BNP 的分泌包括心房的调节性分泌及心的结构性分泌,影响BNP分泌的关键在于心室负及室壁张力的改变。此外,人的脑内也有少量BNP产生。 BNP主要作用于内皮细胞和血管平滑肌细胞特异性受体,激活腺苷酸环化酶,增加细胞内第二信使环鸟苷单磷酸( cGMP)浓度,从而促进利尿、排钠,扩张外周血管,减少肾素、血管紧张素、醛固酮及肾上腺素及内皮系统的活性,降低容量负荷。BNP尚有

10、调节植物神经系统,阻止心肌纤维化和血管平滑肌增殖的作用;还可抑制血管内皮细胞表达组因子(如内皮素)和纤维蛋白溶酶原激活物抑制的表达,阻止充血状态下的血栓形成。 CNP最早是1990年由 Sudoh等从猪脑中分离而得，证明其是由22个氨基酸组成的多肽 ,以后发现人脑中的 CNP结构和猪脑相似，具有生物活性的CNP多肽结构的 C末端有22个氨基酸残基 ,称为 CNP 2222。许多研究结果表明,CNP主要分布在中枢神经系统 ,其神经元在不同种类动物有不同的分布规律。英国的Ueda等3用放免方法测定了三种利钠肽在鼠脑组织的浓度 ,发现 CNP在脑组织中的浓度较高,尤其在小脑中,浓度最高。没有发现其在

11、周围组织 ,包括心脏中的分布,有力地证明其分布在中枢神经系统。也有人用同样方法测得 CNP在鸡的中枢神经系统的存在 ,并用分子生物学方法测定了 CNP在鸡的大脑中的多肽结构 ,推测其具有神经分泌作用4。随着分子生物学发展 ,用反转录聚合酶链反应(PT PCR)可测得 CNP受体的 mRNA并用异羟基洋地黄毒甙配基标记的 cDNA片段杂交 ,证明 CN的基因在小鼠的星型细胞和神经胶质细胞有表达,而且前者比后者高 ,推测出 CNP广泛分布于中枢神经系统 ,特别是调节神经内分泌的部位 ,可能参与了神经调节功能5。我们知道内皮损伤可刺激血管平滑肌增殖，已经研究表明 ,在小鼠的血管内皮细胞损伤时 CNP

12、的产生和分泌增加 ,并且通过聚合酶链反应(PCR)证明这些细胞表面有B受体 ,阐述了CNP上血管内皮细胞分泌1,也证实了其作用的受体为B受体的理论。 利钠肽的肾脏作用 有关利钠肽对肾脏作用的研究已经十分深入。在正常的生理条件下,利钠肽能够增加水、钠的排泄 ,这是它直接作用于肾小管和肾小血管引起的效应8。它可以阻断近曲小管的血管紧张素和皮质层肾小管处的抗利尿激素 ,同时还可以抑制肾髓质内肾小管对钠的重吸收。健康人应用外源性的利尿肽可以增加肾脏的滤过分数 ,这是通过维持入球小动脉的张力，扩张出球小动脉来增加肾小球的滤过率的机制达到的。心衰患者利钠肽对肾脏的作用减弱,这可能与心输出量减少导致的肾脏灌

13、注压的降低相关7。其他可能的因素包括:缩血管因子的分泌增加,包括对抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和内皮素的激活;或A型受体的数量减少或敏感性降低7。另外,可能还与实验用剂量高于临床剂量有关7,8。利钠肽在肺内的作用三种利钠肽均可在肺内高度表达，ANP刺激废通道和血管扩张。注射或吸入ANP使正常和哮喘患者支气管舒张。肺动脉高压患者ANP和BNP水平增加，右室张力增高，过度表达ANP的小鼠对缺氧诱导的高血压具有抵抗性，而ANP缺失小鼠在慢性缺氧诱导的高血压具有抵抗性，而ANP缺失小鼠在慢性缺氧状态下表现为明显肺动脉高压，CNP也可以降低肺动脉高压及纤维化。ANP利钠和利尿作用ANP可增

14、加肾脏肾小球滤过率，抑制钠和水的再吸收，降低肾脏素分泌。ANP依赖性利钠利尿作用通过NPR-A介导，因为NPR-A基因敲除动物完全失去此效应。ANP通过调整入球动脉扩张和出球动脉收缩，使肾小球毛细血管压增加，从而增加肾小球滤过率。除了这些压力效应外，ANP还可抑制钠和水在肾单位的吸收。在近曲小管，ANP抑制血管紧张素刺激的钠和水的转运；在集合管，它通过抑制阿米洛利敏感性阳离子通道降低钠的再吸收。ANP对以上转运过程的作用是通过cGMP依赖性来完成的。利钠肽在心血管疾病发生发展中的作用利钠肽与充血性心力衰竭：大量研究证实,血浆ANP、BNP水平在CHF 时显著增加, 增加的量与心衰程度、心律失常

15、的发生及血流动力学紊乱程度有关。高浓度的ANP、BNP 水平提示长期预后不佳,其中高浓度血浆BNP作为估测预后的危险因素比ANP更有价值。CNP在CHF中是否有作用尚不明确10。本科生毕业论文（设计）翻译文章免疫荧光标记的利钠肽C型受体在大鼠脑内的分布以及与胆碱能神经元和儿茶酚胺能神经元的联系摘要C型利钠肽受体能与所有类型的利钠肽结合。利钠肽C型受体被认为参与了利钠肽的清除，而且最近的科学研究显示它是利钠肽神经调节作用的重要因素。尽管大鼠前脑中利钠肽受体信使RNA的分布已有相关报道，但是脑干中利钠肽受体的分布却仍然没有数据。于是，我们做了一项关于大鼠脑中利钠肽分布以及与胆碱能神经元和儿茶酚胺神

16、经元的联系的免疫荧光研究。NPR-C的免疫荧光反应在，包括中脑导水管周围灰质，动眼神经核，红核和滑车神经核;脑桥中脑桥核，被盖神经核背侧，前庭神经核，蓝斑核，三叉神经运动核，斜方体核，外展神经核和面神经核，还有疑核中的迷走神经背侧运动核，以及延髓中舌下神经核，网状旁侧核，疑核和下橄榄核在内的多个区域被检测到。有趣的是，C型利钠肽受体的荧光反应已在三叉神经运动核中的胆碱神经元，滑车神经核，被盖核，三叉神经运动核，面神经核，迷走神经背侧运动核，疑核和舌下神经。此外，NPR-C免疫性反应已在多个含儿茶酚碱的神经元组织中检测到，包括A6,A5,A1,C3和C1细胞区。这些研究结果证实利钠肽在神经分泌规

17、律和中央心脏血管的整合方面充当重要角色。NPR-C在脑干中的广泛分布支持NPR-C参与利钠肽神经调节作用的假说。关键词：C型利钠肽受体（NPR-C），中脑，脑桥，髓质，乙酰胆碱转移酶，络氨酸羟化酶。利钠肽是三肽荷尔蒙的总称，包括心房肽，脑利钠肽，和利尿肽。（Sudoh et al. 1988 1990 ;Brenner et al . 1990 ）利钠肽与质膜上的受体之间的相互作用。这种相互作用对心血管内分泌系统中的各种生理过程，比如流体的自动动态平衡有一定的作用。利钠肽和它们相应的受体对大脑中的多个区域都起作用，与神经调质的作用相似。（Brown and Zuo Langub et al .

18、 1995, Dicicco-Bloom.et al. 2004:Trachte, 2000.2005; Abdelalim et al. 2006 / 2007）利钠肽的生理作用是从它与细胞表面的感受器相结合开始的。这些包括对ANP和BNP很敏感的NPR-A（利钠肽A型受体）和对CNP有高度特性的NPR-B（利钠肽B型受体），以及NPR-C（NPR-C型受体），它可能包含超过95%的利钠肽。众所周知，NPR-C与所有利钠肽的结合有着密切联系。C型利钠肽受体看起来担任着清洁工的角色。它足以隔离被释放的利钠肽，同时能减少利纳肽的局部浓度，从而有效地使环磷酸鸟苷发挥作用（Maack et al.

19、1987）。然而，有一些证据显示C型利钠肽受体可能与腺苷酸环化酶信号转移系统之间存在着相互作用。这种作用能抑制cAMP的产生，同时还能激活C型磷酸二酯酶，但是这些作用离不开环磷酸鸟苷的作用。（Anand-Srivastava et al. 1990;Murthy et al. 2000）有趣的是，在施万氏细胞中这种受体出现在有丝分裂间期，并调节利钠肽的合成。（Anand-Srivastava and Trachte, 1994; Mur-thy et al., 2000; DiCicco-Bloom et al., 2004）。缺乏利钠肽C-型受体的表达基因NPR3的大鼠表现出血压降低和骨骼畸

20、形。（Matsukawa et al., 1999）。此外，去除NPR-C同样可以削弱PC12细胞表面CNP作为神经传递素的抑制性影响（Trachte,2000）。星型细胞中的NPR-C可以间接抑制ANP的增长。在大鼠的视床下部CNP通过影响NPR-C，抑制下丘脑内神经分泌大细胞系统中钙的流动。虽然在脑中NPR-C表现出调整多种利钠肽，但是关于NPR-C的mRNA出现在亚压部前、后皮质颗粒细胞区，中间视前区，中间视前核，蜗神经腹侧核脉络丛，深层大脑皮质和亚部后皮质，深层皮质，杏仁核后皮质，海马回，杏仁海马回合齿状回的报道很少见到。另外，在猴子大脑皮质和小脑原位杂交研究证明了NPR-C的mRNA

21、在神经元中的定位。但是，到目前为止还没有详尽的形态学研究阐述各个物种脑干内NPR-C的免疫荧光定位。为了进一步证明NPR-C在脑内可能的作用，我们检验了NPR-C在脑内的免疫荧光定位和在脑干胆碱能和儿茶酚胺能神经元的共定位。NPR-C在胆碱能神经元内的分布本实验发现顶盖和顶盖运动核的大部分胆碱能神经元表达NPR-C。在中脑和脑干的运动性神经元内可以观察到NPR-B的mRNA，利钠肽可能在胆碱能神经元特别是顶盖运动核内发挥作用。此外，迷走神经背侧运动核的胆碱能神经元是副交感神经节前神经元，其轴突传递到心肾等脏器。同样的，疑核的一部分胆碱能神经元投射到心脏，并对调控心血管功能和血压有重要作用。NP

22、R-C在儿茶酚胺神经元内分布 本实验发现在篮斑核内TH阳性神经元和NPR-A标记的神经元没有重合，此外，上述儿茶酚胺能神经元没有找到NPR-A免疫标记，因为NPR-B 是CNP的特征受体，实验结果显示在儿茶酚胺能神经元中NPR-C是与CNP而不是ANP 或BNP 绑定的。多巴胺是一种神经传递素，在消极躲避型中间接地影响CNP 的增加和巩固记忆，同时， CNP 调节脑内可卡因敏感的多巴胺的增加。CNP通过与NPR-C结合调节脑干某些区域儿茶酚胺能神经元。此外，调节心血管功能的重要区域腹外侧髓质也含有儿茶酚胺能神经元。讨论NPR-C抗体的特性胞外NPR-C抗体的特异性已经通过Western Blo

23、t实验得到了验证。在大鼠的肾脏和脑干组织匀浆中，抗体已被公认为是一条分子量为65KD的带，与NPR-C蛋白是一致的。我们的实验结果与先前使用蛋白质印迹分析方法证明NPR-C抗体特性的研究是一致的（Tian and Yang ,2006）。在最近的研究中，科学家把肾作为阳性对照，原因是NPR-C在大数情况下是由肾小球分泌的（Martin et al., 1989）。这些结果和数据验证了与NPR-C抗体结合的的的确确是NPR-C。脑干中免疫荧光标记的NPR-C的定位本项研究是第一次详尽描述大鼠脑干中免疫荧光标记的NPR-C与胆碱神经元和儿茶酚胺能之间的联系。NPR-C主要定位于神经结构，另外免疫荧

24、光标记的NPR-C神经细胞广泛地分布于某些具有明显独特功能的核心区域。NPR-C阳性神经元可以在与心血管调节有关的区域观察到，包括导水管周围灰质、蓝斑核、脑桥核、腹外侧A5细胞群、迷走神经背侧核、疑核、髓质腹外侧的A1细胞群。此外，NPR-C还有不同功能的区域定位，包括红核、背侧被盖核、斜方体核、顶盖运动核、下橄榄核。这些结果显示了脑干内NPR-C的更广泛的功能。而且，脑干内类胆碱能神经元和儿茶酚胺能神经元内存在NPR-C表明NPR-C可作为神经调质。NPR-C广泛存在于动眼神经核、红核、蓝斑、迷走神经背核、舌下神经核、侧面网状核、疑核和下橄榄核。这些区域有许多表达由ANP、BNP选择受体的N

25、PR-A的神经元。因此，这些区域的NPR-C作为一种清除型受体可能会通过ANP、BNP，从而间接调节NPR-A，进一步调节cGMP的浓度。结论NPR-C 在脑干内的密集定位说明可能经由胆碱能和儿茶酚胺神经元有神经调节功能。NPR-C阳性神经元在脑干内与心血管调节有关的广泛的区域都可以找到，表明NPR-C间接地调节各种生理功能。 心肌缺血对大鼠肾皮质内NPR-C表达的影响目录中文摘要、关键词引言11、材料与方法21.1 实验动物及分组21.2仪器和试剂21.2.1 实验动物来源21.2.2 主要实验仪器21.2.3 实验药品31.2.4 主要试剂的配制32、实验步骤5 2.1急性心肌缺血动物模型

26、的复制5 2.2 TTC检测大鼠心肌梗塞面积（验证结扎冠脉手术的成功率）52.3 Western Blot 印记反应52.3.1 蛋白提取并检测浓度52.3.2 Western Blot具体操作过程52.3.3 Western Blot印记反应62.4 结果处理63、实验结果6 3.1 TTC染色结果7 3.2、Western Blot结果7 4、讨论9 5、小结9 参考文献10 英文摘要、关键词 12 心肌缺血对大鼠肾皮质内NPR-C表达的影响摘要 目的 观察心肌缺血对大鼠肾皮质内NPR-C表达的影响，探讨利钠肽的相关作用。方法 健康成年雄性SD大鼠，麻醉后打开胸腔，结扎冠状动脉左前降支，建

27、立急性心肌缺血模型。分别按照实验安排，在不同时间点将大鼠麻醉后，打开腹腔取出肾脏，并剥离肾皮质。加入裂解液后提取组织总蛋白，并运用Western Blot技术检测NPR-C蛋白表达的变化。结果 手术3天后小组肾皮质内NPR-C表达量显著降低，术后18天其表达量明显上升，术后7天、14天、28天与对照组无明显差异。假手术组NPR-C表达量与空白对照组无明显差异。结论 结果表明，冠脉结扎后，急性心肌缺血迅速影响了大鼠肾皮质内NPR-C蛋白表达，是缺血心肌应激反应之一。关键词 心肌缺血，脑，大鼠，C型利钠肽受体，肾皮质 引 言心肌缺血是指由于心脏冠脉循环改变，引起了冠脉血流和心肌需求之间的不平衡，从

28、而导致心肌损害。其中，与缺血性心脏病关系最为密切。心房利钠肽( Atrial Natriuretic polypeptide，ANP) 及其家族中的脑利钠肽( Brain natriuret peptide, BNP)、C 型利钠肽( C-Type natriuretic peptide, CNP)是心房、心室肌及血管内皮细胞产生和分泌的一类具有强烈利尿、排钠、扩血管及抑制醛固酮分泌等作用的多肽类激素，在体内参与许多疾病的病理过程，特别在治疗、缓解、评估心血管疾病等方面有着广阔的应用前景。循环中利纳肽的终浓度受其合成和释放速率的影响，而从循环中清除利纳肽的速率也是重要的影响因素。循环中的利纳肽

29、通过两种方式清除：受体调节的内吞形式以及中性内肽酶降解的方式。利纳肽是通过其受体作用于机体的，在人和大鼠的心肌组织检测到的利纳肽受体（natriuretic peptide receptor，NPR）有四种亚型，其中C型利钠肽受体(NPR-C)能够与所有的利钠肽相结合，被认为参与了利钠肽的清除。而且最近的科学研究显示它是利钠肽神经调节作用的重要因素。NPR-C能够隔离被释放的利钠肽，减少肽的局部浓度，从而有效地使环磷酸鸟苷发挥作用。利钠肽家族作为内分泌激素，能够通过调节心脏和肾脏的功能达到维持机体的内稳态。对利钠肽的最新研究表明，心力衰竭等心脏病患者的利钠肽水平升高，升高的利钠肽提示心血管事件

30、的高危险性，监测利钠肽能够帮助诊断和判断预后。利钠肽能够抑制心肌的过度增殖和纤维化，具有改善心肌梗死和心衰时的心肌重构作用。脑钠肽是一种最重要的利钠肽，它可以作为心衰和其他心血管疾病的重要生物标记物，能够帮助我们了解肺动脉高压和粥样硬化性血管病等心血管疾病的进展。另外，合成的多种利钠肽已经被试验用来治疗急性充血性心衰。针对多种重组利钠肽的多个临床研究还在实验阶段，主要的方向包括它们在心脏手术中对心脏、肾脏的保护作用和抑制心肌重构的作用。本实验旨在采用Western Blot技术研究心肌缺血与大鼠肾脏皮质内NPR-C表达之间的联系，以探讨在急性心肌缺血伤害性刺激作用下，大鼠肾脏皮质内NPR-C表

31、达量的变化。1、材料与方法1.1 实验动物及分组健康成年雄性SD大鼠30只，体重280 g-330 g，由河北医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK(冀)2003-1-003；合格证号：DK0405-0003）。购入后于避强光、温暖安静的环境中饲养48小时。随机分为TTC染色组及实验组，实验组分组情况如下所示。 手术组手术后3日取材 3只手术后3日取材 3只手术后3日取材 3只手术后3日取材 3只手术后3日取材 3只假手术组 3只空白对照组 3只TTC染色组 3只 1.2 仪器和试剂1.2.1实验动物来源成年雄性SD大鼠体重280 g-330 g，由河北医科大学实验动物中心提供（许可证号

32、：SCXK(冀)2003-1-003；合格证号：DK0405-0003）。1.2.2 主要实验仪器匀浆机；低温离心机 Eppendorf；BIO-RAD 电泳仪；BIO-RAD 半干转移系统；超纯水系统 MILLIPORES；扫描仪 佳能 1.2.3 实验药品预染蛋白Marker，Fermentas；RIPA组织/细胞裂解液，Solarbio；BCA法蛋白定量试剂盒，GENEray；ECL 发光试剂，PIERCE；显影胶片，柯达；TTC 上海化学试剂采购供应站分装；PVDF膜 Millipore；Tris Solarbio；SDS Sigma；ECL Thermo；TWEEN-20 Solar

33、bio；甘氨酸 Solarbio；Beta抗体 北京博奥森生物技术有限公司；NPR-C抗体 abcam；辣根酶标记抗兔 IgG Solarbio；丙烯酰胺 Solarbio；甲叉双丙烯酰胺 Solarbio；过硫酸胺 Solarbio；丽春红 Solarbio；显影液 石家庄市化工十厂；定影液 石家庄市化工十厂；过硫酸铵 Solarbio；考马斯亮蓝R-250 Solarbio；TEMED usb1.2.4 主要试剂的配制1.0mol/L TrisHCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.125 g 蒸馏水 150 ml 浓盐酸调PH到6.8 蒸馏水 至250 ml SDS

34、1.0 g10过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1 g 超纯水 1.0 ml1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.5 g 蒸馏水 150 ml 浓盐酸调PH到8.8 蒸馏水 至250 ml SDS 1.0 g30% Arc/Bis Arc 29.2 g Bis 0.8 g 蒸馏水 至100 ml5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.15 g 甘氨酸（MW75.07） 72 g SDS 5 g 蒸馏水至 1000 ml5X转膜缓冲液 Tris(MW121.14) 15.15g 甘氨酸（MW75.07） 72g 蒸馏水至 1000 ml

35、用时取100 ml 5X转膜缓冲液+100 ml甲醇+100 ml蒸馏水TBS NaCl 8 g KCl 0.2 g Tris 6 g 调pH值至7.4 蒸馏水定容至 1000 mlTBST 缓冲液 20Tween20 1.65 mlTBS 700 ml封闭液 脱脂奶粉 5 g TBST 100 ml丽春红染液10X 丽春红S 0.5 g 冰乙酸 2 ml 蒸馏水 定容至100 ml考马斯亮蓝R-250染色液 CBB-R250 0.5 g 甲醇 125 ml 乙酸 35 ml 去离子水 定容至500 ml5X蛋白上样缓冲液 1.0mol/L TrisHCl（pH6.8） 0.6 ml甘油 5

36、ml10% SDS 2 ml-巯基乙醇 0.5 ml1% 溴酚蓝 1 ml蒸馏水 0.9 ml2.实验步骤2.1急性心肌缺血动物模型的复制三月龄成年雄性大鼠，200g-250 g左右体重，戊巴比妥钠麻醉（25-40 mg/kg ip.），在第四到第五肋骨间开胸，用6号缝合线迅速结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支。按设计分别在手术后3天、7天、14天、18天和28天取材。假手术组只打开胸前，不结扎心脏。2.2三苯基氯化四唑法（Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC）检测大鼠心肌梗塞面积（验证结扎冠脉手术的成功率）0.1%的TTC（2,3,5-triphenyl tetra

37、zolium chloride, Sigma）用于确定左心室梗死面积。戊巴比妥钠麻醉大鼠（60 mg/kg ip.）,迅速分离心脏，沿房室沟轴横切心脏成2.0-2.5mm厚的断面，从心间到基底面等分成5个断面，用0.1 %的TTC生理盐水溶液37 孵育30分钟。心肌梗死面积用每个断面坏死组织的面积法计算。脱氢酶可以转换TTC成红色的以标记组织成暗红色。发生心肌梗死的组织不会被TTC染色，因其脱氢酶流失。染色的心肌断面用4 %多聚甲醛固定48小时厚在梯度酒精中脱水后，进行石蜡包埋，观察其组织学结构变化。2.3Western Blot 印记反应2.3.1蛋白提取并检测浓度模型建立后使动物在安静环境

38、下分别存活3、7、14、18、28天。依实验设计，在不同时间点取材，动物经称重后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉（60 mg/kg ip.）。用冷的生理盐水灌流冲血。迅速打开腹腔取出肾脏，并剥离肾皮质。三只大鼠肾皮质混合后称重，按1：:10（w/v）加入RIPA裂解液（每1mlRIPA中加入10l PMSF）。在高速匀浆机上进行匀浆。充分匀浆后置于4离心机离心（12000 r/s，5 min）。取上清液-20保存。应用BCA法蛋白定量试剂盒测定所提蛋白浓度。2.3.2 Western Blot实验步骤根据说明书安装玻璃板。配制10%分离胶溶液，在加入TEMED及AP，胶开始聚合后，迅速将分离胶灌注到两层玻璃板间，并在分离胶上注入一层双蒸水。室温下待分离胶完全聚合后，倒去上层双蒸水，并用双蒸水洗涤数次除去未聚合的丙烯酰胺。用滤纸在边缘洗净残留的液体。配制5%积层胶并注入玻璃板之间，小心的插入梳子，避免产生气泡。按预定顺序在空中加