化学发光法的原理技术要点及评价应用.ppt
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1、化学发光免疫技术,第一节 发光与化学发光剂第二节 发光酶免疫测定(CLEIA)(chemiluminescence enzyme immunoasssay)第三节 化学发光免疫测定技术(CLIA)(chemiluminescence immunoassay)第四章 电化学发光免疫测定技术(ECLI)(electrochemiluminescence immunoassay),化学发光免疫技术:集灵敏的化学 发光分析和特异的抗原抗体免疫测 定于一体的检测技术。,概 念,特点:特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。,化学发光免疫技术的类型,按发光剂不同分为 1.发光酶免
2、疫测定(CLEIA)chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.化学发光免疫测定技术(CLIA)chemiluminescence immunoassay 3.电化学发光免疫测定技术(ECLI)electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分 1.微粒子化学发光免疫测定 2.磁颗粒化学发光免疫测定,第一节 发光与化学发光剂,一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时,释放出的能量表现为光的发射。,1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态,当回复至基态时发出较长波长的可见光。,2.生物发光:反应底物在荧光素酶
3、的催化下利用 ATP产能,生成激发态的氧化荧光素,后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。,3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。化学发光是一个多步骤的过程。,荧光素酶ATP;O2;Mg2+,氧化萤火虫荧光素,萤火虫荧光素,生物发光,返回,光+AMP+O2+CO2+,化学发光,机制:某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时,以发射光子的形式释放能量(即发光)。,二、化学发光剂,化学发光剂或发光底物:在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。发光剂分为荧光素、生物发光
4、剂、化学发光剂,能参与化学发光反应;与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂;偶联后仍保留高的量子效应和反应动力;应不改变或极少改变被标记物的理化特性,特别是免疫活性。,化学发光剂应符合以下几个条件,返回,1.酶促反应的发光底物,是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。CLEIA中常用的酶有HRP和AP HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸 AP的发光底物有AMPPD、4-MUP(荧光底物)特点:可作标记物、也可作过氧化物酶的底物,1.1 鲁米诺,H2O2/OH HRP,+N2+H2O+光,对-羟基苯乙酸(HPA),HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体(荧光 物质),在350nm
5、激发光作用下,发出450nm波长 的荧光,可用荧光光度计测量。,1.2 HPA,H2O2HRP,+荧 光,氧化二聚体,AMPPD,AMPPD在碱性条件下,被AP酶解生成相当稳定的 AMP-D阴离子,其有230min的分解半衰期,发 出波长为470nm的持续性光,在15min时其强度 达到高峰,1560min内光强度保持相对稳定。,光,AP/OH HPO4 2,1.3 AMPPD,4-MUP,4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮,在360nm的 激发光的作用下,发出448nm的荧光,可用荧 光光度计进行测量。,荧光,AP,1.4 4-MUP,4-MU,360nm激发光,H3PO4+,2.直接化
6、学发光剂,特点:不需催化剂,只需改变溶液的pH等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、信比高,发光量与AE浓度呈线性关系。常用试剂:吖啶酯(acridinium,AE),+CO2+光,3.电化学发光剂,是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。特点:反应在电极进行;电子供体为:三丙胺(TPA)化学发光剂:三联毗啶钌,返回,三联毗啶钌分子结构图,第二节 发光酶免疫测定(CLEIA),一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一 步酶反应所用底物为发光剂,通过发光反应 发出的光在特定的仪器上进行测定。,二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为:1.荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定
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