科内培训基因变异的表述方法专业知识讲座课件.ppt

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1、,上集回顾,DNA的化学结构。查找序列。正义链和反义链。碱基书写顺序。mRNA和前体mRNA。外显子和内含子。CDS和UTR。外显子 Coding DNA。全基因突变、热点突变和已知突变。,HGVS规范了基因及蛋白的变异表述,http:/www.hgvs.org/mutnomen/,表述不统一将造成互相理解障碍,“突变”与“多态性”的不同,Mutation突变,Change 改变（罕见的）Disease-causing change 致病改变,Polymorphism多态性,Change in 1%in population人类群体中大于1%的改变Not disease causing cha

2、nge不致病的改变,建议使用的词语,Mutation突变,Polymorphism多态性,负面,正面,建议使用中性词,Variant/Alteration变异CNV 拷贝数变异SNV（Not SNP）单核苷酸变异,“指南”的定义,测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定,PGM中的Variant,VariantCaller的导出结果,写成“SNV”为好,报告有待规范,写成“变异”为好,规范的基因名称-1,网址：www.genenames.org或搜索引擎搜索关键词“HGNC gene”,规范的基因名称-2,参考序列出处-1,基因的核酸信息包括染

3、色体基因组DNA序列和mRNA序列，核酸信息参考NCBI GenBank核酸序列数据库参考序列（Reference Sequence，RefSeq）。基因组DNA序列GenBank注册号前面用NT、NC或AC加下划线进行标注，其中以“NT_”标注的序列为BAC克隆或鸟枪测序法获得的不完整的基因组测序序列。如10号染色体上的片段NT_030059，同一序列号有不同的版本号时，后面用点加版本号表示，如NT_030059.14。成熟mRNA转录本序列的注册号前用NM加下划线（NM_）进行标注。微小RNA（microRNA，miRNA）的核酸序列信息参考miRBase序列数据库，miRNA前体序列前用

4、“MI”标注，miRNA的成熟体序列前用“MIMAT”标注。测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定,参考序列出处-2,美国国立生物技术信息中心（NCBI）收录的参考序列编码具有权威性及唯一性。其中前缀“NM_”表示为mRNA序列，“NP_”表示多肽序列，“NG_”表示基因组序列。基因组参考序列应列出完整基因序列，包括5以及3非编码区（UTR）。当使用某段编码DNA参考序列描述突变时，应选择合适的转录体，且转录体的起始转录点应当明确，例如选择最常见的转录体，或者是已知的最大转录体，或者具有组织特异性的编辑转录体。当某一参考序列具有多种转录方式时

5、，选择NCBI数据库里注释最全面的版本。肿瘤个体化检测治疗指南（试行）国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定,参考序列出处-HGVS有不同看法,HGVS建议使用LRG（Locus Reference Genomic）序列作为首选参考序列。如果该基因没有LRG序列，则采用RefSeq作为参考序列。,HGNC的页面,LRG序列的web页面,点击这些绿色的+号得到有意思的内容,前缀应指出突变位于哪种序列中,“g.”表示基因组序列，如g.476AT。“c.”表示Coding DNA（编码DNA）序列，如c.76AT。“m.”表示线粒体DNA序列，如m.8993TC。“r.”表示RNA序列，如r

6、.76au。“n.”表示非编码RNA序列。“p.”表示蛋白质序列，如p.Lys76Asn。,对于DNA变异的表述，“c.”优于“g.”直观地得知该变异点在外显子上还是内含子上，会不会造成氨基酸编码改变，与表型联系起来。,序列位置编号-1,基因组、线粒体DNA、RNA、非编码RNA、蛋白序列：以参考序列的第一个碱基或氨基酸确立为1，直接数其在对应参考序列中的位置即可。如：g.476，m.9222，p.76。,序列位置编号-2,Coding DNA（编码DNA）序列：将Coding DNA看成连续的（排除内含子间隔），以起始密码子ATG的第一个碱基A确立为1，以终止密码子的最后一个碱基确立为结束N

7、。若碱基在Coding DNA范围内，则其位置为1N区间内的自然数，如c.112。起始密码子ATG的上游的第一个碱基确立为-1，一直向5端推移编号为-2、-3，整个5UTR区域位置均为负数表示，如c.-72。没有“0”碱基。终止密码子下游的第一个碱基确立为*1，一直向3端推移编号为*2、*3，整个3UTR区域位置均为“*自然数”表示，如c.*85。对于内含子起始片段内的位点，以上一外显子最后一个碱基的位置、加号和距离这个碱基的位置表示，如c.77+1；对于内含子末端的位置，以下一外显子第一个碱基的位置、减号和距离这个碱基的位置表示，如c.77-2。“+”和“-”的分界线需谨慎决定。5UTR若有

8、内含子，内含子上的碱基位置以“-23+1,-23+2,.,-22-2,-22-1”形式表示；3UTR若有内含子，内含子上的碱基位置以“*154+1,*154+2,.,*155-2,*155-1”形式表示。,不建议使用c.IVS1+1G，c.IVS1-2G形式的表示（IVS：intervening sequence）。原因：外显子/内含子的编号比Coding DNA编号更易引起混乱。,序列位置编号-列表举例,c.171,c.247,c.246,c.312,序列位置编号-外显子&内含子举例,c.246+6,c.247-4,序列位置编号-5端举例,c.-26,c.-25-6,c.-25,c.1,变异

9、的表述总体规范-1,“”（英文输入法的大于号）表示碱基替换，如c.76AT。“_”（英文输入法的下划线，不是中划线）表示从起始位置编号到终止位置编号范围的受到影响，如c.76_78del。“del”表示缺失，如c.76delA。“dup”表示重复，如c.8dupG（不是c.8_9insG，重复和插入的定义不同，见后）。“ins”表示插入，如c.76_77insG。“delins”表示同时有缺失和插入，如c.112_117delinsTG。“inv”表示倒位，如c.76_83inv。“con”表示转换，如c.123_678conNM_004006.1:c.123_678。“fs”表示移码（fra

10、me shift），变异导致在起始密码子和终止密码子之间的开放阅读框发生改变，如p.Arg97Profs*23。“ext”表示延伸（extension），变异发生在起始密码子或终止密码子上，导致氨基酸序列较之原序列变长了。如p.Met1ValextMet-12。“()”（英文输入法的圆括号）表示发生变异的具体位置不确定，如c.(67_70)insG，但是圆括号内的位置范围要尽可能缩到最小。“”（英文输入法的方括号）表示发生在某个等位基因上，如c.76AT；或者已确定的数量，如c.123_1244。,变异的表述总体规范-2,DNA：前缀（c.）+位置编号（76）+参考序列碱基（A）+变化（）+改

11、变后的碱基（如果有）（T）：c.76AT。碱基以大写字母表示，包括A、T、G、C、Y、R、W等。RNA：前缀（r.）+位置编号（39）+参考序列碱基（a）+变化（）+改变后的碱基（如果有）（u）：r.39au。碱基以小写字母表示，包括a、u、g、c、y、r、w等。蛋白：前缀（p.）+参考序列氨基酸（Trp）+位置编号（52）+变化（没有“”，但“del”、“ins”等不变）+改变后的氨基酸（如果有）（Ala）：p.Trp52Ala。氨基酸以三字母（第一个字母大写）或单字母表示，如Trp或W。建议以三字母表示（第一个字母大写），不建议以单字母表示，因为单字母容易和碱基混淆。,变异的表述总体规范-

12、关于氨基酸终止,HGVS：用“Ter”或“*”（英文输入法且英文字体下的星号键）表示氨基酸翻译终止，如p.Asn26Ter或p.Asn26*，不使用“X”表示氨基酸翻译终止。原因：IUPAC-IUB(International Union of Pure and Applied Chemistry，International Union of Biochemistry and Molecular Biology)已规定“X”用来表示未指定或未知氨基酸，所以不能用来表示终止。,“X”符号代表终止密码子。例如，p.Gly542X表示542位点的甘氨酸残基被终止密码子所代替。肿瘤个体化检测治疗指南（

13、试行）,此处存在争议,变异的表述替换,替换（substitution）：一个碱基/氨基酸被另一个碱基/氨基酸替换。特征是“一对一”。如果是一个碱基/氨基酸变异成多个碱基/氨基酸，那是缺失-插入。如果是多个碱基/氨基酸变异成一个碱基/氨基酸，那是缺失或缺失-插入。如果是多个碱基/氨基酸变异成多个碱基/氨基酸，那是缺失-插入或转换。故没有“c.76_77AGTT”这种写法。用“”（英文输入法的大于号）表示某个碱基变成了另一个碱基，不建议使用“A76T”类似的形式表示。但是氨基酸替换没有“”，要写成“p.Trp52Ala”这样的形式。举例：c.76AT,p.Glu26Asp。,变异的表述缺失,缺失（

14、deletion）：原本该有的没有了。举例：c.76del或c.76delA；c.76_78del或c.76_78delACT（可以不用写成c.76_78del3）；p.Gln8del；p.Gln8_Ala10del。氨基酸移码变化见后。最靠近3端法则（most 3 position）：缺失的碱基，认为其靠近3端，而不是5端。ACTTTGTGCC变成ACTTGCC，缺失了哪三个碱基？ACTTTGTGCC还是ACTTTGTGCC？TGT比TTG更靠近序列的3端，故认为缺失了TGT（c.5_7del），而不是TTG（c.4_6del）。ctttagGCATG变成cttagGCATG，写成c.301

15、-3delT，而不是c.301-4delT、c.301-5delT。但是该法则有例外，在描述外显子/内含子边界的变异时，认为缺失的碱基影响外显子大于影响内含子。如CAGgtg变成CAgtg，写成c.3delG，而非c.3+1delG。不确定断裂位置的情况（见于使用MLPA和PCR法发现的外显子缺失），要使用圆括号和预估的断裂位置范围，例如：c.(87+1_88-1)_(300+1_301-1)del，表示某基因Exon3、4缺失，5断裂点在Intron2（c.87+1_88-1，不确定具体在哪处），3断裂点在Intron4（c.300+1_301-1，不确定具体在哪处）c.(?_-30)_(1

16、2+1_13-1)del，表示从基因5某个位置开始至Intron1中的某个位置缺失。c.(?_-1)_(*1_?)del，表示整个基因都缺失了。提醒：不要随便打“？”。能确定具体断裂位置就不要打问号。,变异的表述重复,重复（duplication）：碱基或氨基酸多出了一份拷贝（不是多份拷贝），并且多出来的部分直接加在其3端。如果不是直接加在其3端，而是插到了其它地方，那叫“插入”。举例：c.7dup或c.7dupT（注意不写成c.7_8insT）；c.77_79dup或c.77_79dupCTG；c.(87+1_88-1)_(301+1_302-1)dup；p.Gly4_Gln6dup；描述重

17、复的位置时也须符合“最靠近3端法则”。例如：MKMGHQHQCC变成MKMGHQHQHQCC，写成p.His7_Gln8dup，不写成p.His5_Gln6dup.,变异的表述多份重复,多份拷贝重复（repeat）：碱基或氨基酸多出了多份拷贝，并且多出来的部分直接加在其3端。如果不是直接加在其3端，而是插到了其它地方，那叫“插入”。表示形式：“第一个重复单元起始位置_第一个重复单元终止位置+总共的重复数”，如c.123_1244。或者，“第一个重复单元起始位置+重复单元+总共的重复数”，如c.123TG4。不用“c.123_124TG4”形式表示显得冗余。特殊举例：脆性X综合症FMR1基因5端

18、重复单元：c.-128_-12679确定共有79个重复单元；c.-128_-126(600_800)重复单元数在600800之间，具体数量不确定（通过Southern Blot做出的结果）。不要写成c.-128GGC79，因为该基因中有的GGC重复单元可能变异为GGA单元，写成c.-128GGC79就不符合实际情况。亨廷顿舞蹈症HTT基因重复单元：c.53AGC21,p.Gln23（为什么此处不写氨基酸编号原因不明）。群体研究：g.1209_452312_45该片段在人群中重复1245次不等。,变异的表述插入,插入（insertion）：原本没有的却有了，且多出的部分不是其5端紧邻的碱基或氨基

19、酸的拷贝和“重复”的区别。举例：c.51_52insGAGA；c.123+54_123+55insAB012345.2:g.76_420；p.Lys2_Met3insGlnSerLys；p.Trp182_Gln183ins17；注意：所描述插入位置一定是由下划线连接起来的范围，而非单个点。“c.51_52insGAGA”清晰的表明了插入位置是在c.51和c.52之间。“c.51insGAGA”就会引起混淆：插入位置是在c.51的5端还是3端？不确定时需打圆括号，如“c.(67_70)insG”不确定是在c.67c.70间的哪个位置插入了G；“c.11_12ins(2)”或者“c.11_12in

20、sNN”确定插入了两个碱基，但不确定插入的碱基序列是什么；“c.11_12ins(100)”或者“c.11_12insN100”确定插入了100个碱基，但不确定插入的碱基序列是什么；,变异的表述插入（续）,如果插入DNA或RNA的碱基很多（多到无法把所有插入的碱基都写出来），应尽量寻找所插入的碱基来源，加入到描述中，如“c.123+54_123+55insAB012345.2:g.76_420”。实在找不到插入碱基的来源，怎么办？HGVS未指明。个人看法，仅供参考：可以用“ins+插入碱基的数量（加括号）”来表示，数量要打括号，如“c.11_12ins(100)”。不直接写成“c.11_12i

21、ns100”。但，在已清晰地描述了DNA或RNA的变异基础上，氨基酸变异描述可以不加括号，直接写插入的数量，如“p.Trp182_Gln183ins17”。,变异的表述缺失-插入组合,先缺失，再插入。同时满足缺失和插入的表述规范。举例：c.112_117delinsTG或者c.112_117delAGGTCAinsTG；c.113delinsTACTAGC或者c.113delGinsTACTAGC；p.Cys28delinsTrpVal；氨基酸的在码变异（in frame）和移码变异（frame shift）：在码变异（in frame）：一个或多个氨基酸变成另外的一个或多个氨基酸，但其它氨基

22、酸编码不受影响。DNA的单碱基替换，或碱基缺失/增加的数量是3的倍数，可导致在码变异。移码变异（frame shift）：DNA的碱基缺失或增加不是3的倍数，造成在起始密码子和终止密码子之间的开放阅读框发生了变化。变异发生处C端下游的氨基酸编码都受到影响。注意以上概念和蛋白“延伸”的区别。,变异的表述移码变异,在码变异的表述：没有“fs”，如“p.Gln8_Ala10del”；“p.Cys28delinsTrpVal”。移码变异的表述：1、短描述：前缀+受影响的第一个氨基酸+fs，如“p.Arg97fs”。2、长描述（推荐采用）：前缀+受影响的第一个氨基酸的变异情况+fsTer（或fs*）+变

23、异后的新终止位置，如“p.Arg97Glyfs*26”。不要加入“del”、“ins”、“dup”等字眼。关于确定变异后新的终止位置：受影响的第一个氨基酸确立为1，然后再新的开放阅读框中，其C端下游的氨基酸依次编号为2、3#。#即为终止密码子所对应的氨基酸位置编号。把#直接连在“fsTer”或“fs*”的后面。举例：变异后新的开放阅读框为Trp112（受影响的第一个氨基酸，原本是Asn）,Ala113,Gln114,Asp115,Leu116,*117。则变异写作“p.Asn112Trpfs*6”（117-112+1=6），不是写作“p.Asn112Trpfs*5”，“p.Asn112Trpf

24、s*117”，亦或“p.Asn112Trpfs*118”。在变异后新的开放阅读框中没有发现终止密码子，则“#”用“？”代替，如“p.Ile327Argfs*?”。,查看移码后的翻译序列-1,http:/www.bio-,查看移码后的翻译序列-2,氨基酸的特殊变化-1,#同义变化：氨基酸没有改变，用“p.(=)”表示。不使用“p.Leu54Leu”或“p.L54L”形式表示。打括号表明没有在蛋白水平和RNA水平上进行实验实证。不建议用“p.Leu54=”或“p.L54=”形式表示（仅是不建议，不是禁止）。但国内的指南对同义变化的表述没有谈及。#无义变化：用“Ter”或“*”（英文输入法且英文字体

25、下的星号键）表示氨基酸翻译终止，如p.Asn26Ter或p.Asn26*，不使用“X”表示氨基酸翻译终止。存在争议。特殊例子：p.*110Glnext*4或p.*110Qext*4，表示原110位氨基酸应为终止位置“*”，但变成了Gln，延伸出了4个新氨基酸（包括这个Gln），然后在114位终止。即Gln110（原本是*）、Ala111、Asp112、Trp113、*114。p.*321Argext*?或p.*321Rext*?，表示原321位氨基酸应为终止位置“*”，但变成了Arg，延伸出了很多个新氨基酸，没发现终止密码子，不知道在哪里终止，因此打上“？”。,氨基酸的特殊变化-2,#第一氨基

26、酸的变化：因为启动子区或起始密码子的变异导致没有蛋白翻译出来，并且提供了实验数据支持，则用“p.0”表示。因为启动子区或起始密码子的变异推测没有蛋白翻译出来，不能提供实验数据支持（这种情况较常见），则用“p.0?”或“p.Met1?”表示。因为启动子区或起始密码子的变异导致翻译起始位点改变：1、翻译起始位点变到了上游举例：“p.Met1ValextMet-12”或“p.M1VextM-12”，表示原第一位Met变成了Val，新的氨基酸较之参考氨基酸序列多出了12个氨基酸（从Met-12到Thr-1）。新的第一个氨基酸变成了Met-12。编号规则与Coding DNA 5UTR编号规则一致。同样

27、没有“0”位氨基酸。2、翻译起始位点变到了下游举例：“p.Phe2_Met46del”或“p.F2_M46del”，表示发生变异后，较之于参考氨基酸序列相当于原第2位的Phe到第46位的Met都缺失了。为什么不是写成“p.Met1_Lys45del”？,原序列：Met1、Phe2Lys45、Met46、Ala47、新序列：Met1、Phe2Lys45、Met1、Ala2、对于氨基酸翻译，永远有第1位的Met。但是在DNA中，“c.1AC”写法是正确的。,变异的表述其它,倒位（invertion）：如c.203_506inv或c.203_506inv304。转换（conversion）：如g.1

28、23_678conNG_012232.1:g.9456_10011。易位（translocation）：如t(X;4)(p21.2;q35)(c.301-148_301-147)。重排（rearrangement detected by FISH and Array）：如hg19 chrX:g.(32218983_32238146)_(32984039_33252615)del。嵌合（mosaicism and chimerism）：如c.83G=/83GC，c.=/83GC。在同一等位基因上/在不同等位基因上/不确定是否在同一等位基因上：如c.76AC;83GC，c.76AC;83GC，c.

29、76AC(;)83GC，p.Trp13*;Pro43Ala，p.Trp13*;Cys28Arg。,关于SNP和基因型的表述,http:/www.hgvs.org/mutnomen/disc.html#1or3HGVS不赞成多态性描述成“c.76A/G”类似形式。多态性、突变、变异应用同一种形式描述：c.76AG。原因：判断某个变异是致病还是不致病通常是很困难的，不应在表述上有所区别，否则会造成误解。建议多态性描述方式：OPRM1:c.118AG;=OPRM1:c.=;=OPRM1:c.118AG;118AGOPRM1:c.118AA homozygotes OPRM1:c.118GA heterozygotes OPRM1:c.118GG homozygotes,关于从基因变异到蛋白变异,HGVS认为，基因上发生了变异，不代表蛋白一定会发生变异。只有做过了mRNA水平和蛋白水平的研究确证，有了证据支持后，才能认为该基因变异会导致蛋白变异。没有做过mRNA水平和蛋白水平研究，不能肯定地认为基因变异会传导至蛋白。,c.76AG,p.Glu26Asp,?,总结,突变、多态性、变异的不同。规范的基因名称。参考序列出处。前缀表述。序列位置编号。变异表述的总体规范。替换、缺失、重复、多份重复、插入、缺失-插入组合等的表述。一些氨基酸表述的特殊情况。,谢 谢！,