阿莫西林中间体的制备及拆分.doc

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1、D-对羟基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine,D-HPG),化学名为D-氨基对羟基苯乙酸,分子式为C8H9NO3,分子量为167. 2,是白色固体粉末,熔点为240,微溶于乙醇和水.D-对羟基苯甘氨酸是合成广谱抗生素阿莫西林、头孢羟氨苄的重要原料1,因此D-对羟基苯甘氨酸的合成研究具有重要的应用价值.国内外都是先合成外消旋的DL-对羟基苯甘氨酸(DL-HPG),然后用化学或生物技术拆分法获得D-对羟基苯甘氨酸.现就国内外关于D-对羟基苯甘氨酸合成工艺的研究进展进行综述. 1DL-对羟基苯甘氨酸的制备DL-对羟基苯甘氨酸的制备主要有苯甲醛法和乙醛酸法两种路线.1. 1苯甲

2、醛法2苯甲醛法用对羟基苯甲醛,碳酸氢铵与氰化钠环合成对羟基苯海因,再经碱性水解,开环制备DL-对羟基苯甘氨酸.反应方程式如下:这种合成路线利用最早,也比较成熟,但是该路线收率不高,且需要使用剧毒品氰化钠,现已很少使用.1. 2乙醛酸法乙醛酸法是上世纪90年代才形成的,是以乙醛酸为原料来合成D-对羟基苯甘氨酸.1. 2. 1对羟基扁桃酸氨解法对羟基扁桃酸氨解法是以苯酚、乙醛酸为原料,氨基甲酸铵为氨化剂在5070进行反应,通入N2保护,可以得到纯度大于99%的D-对羟基苯甘氨酸,收率达到65%以上,反应条件较易控制3.其反应式为:1. 2. 2乙醛酸、苯酚、氨基磺酸法用乙醛酸、苯酚与铵盐作用,一步

3、法合成DL-HPG,此法原料易得、价格便宜,但反应时间长,收率偏低.现在对此法进行改进,以氨基磺酸代替原工艺中的铵盐,则反应收率高,且后处理也容易进行,若添加适当的催化剂,可进一步缩短反应时间.此法在我国石家庄、武汉等厂家普遍采用.使用乙醛酸、苯酚、氨基磺酸4制得DL-HPG,温度控制在4060,反应56 h,对羟基苯甘氨酸的收率为66. 7%,经母液套用后,收率可以达到83. 8%.加入相转移催化剂苄基三乙基氯化铵5,可将亲油性的苯酚转移到亲水性的乙醛酸相中,使反应较易进行.单程收率达70%以上,母液回收套用后总收率达75%以上,经高效液相色谱法测得产品纯度为99. 1%.此法反应时间短、收

4、率高.1. 2. 3对羟基苯海因水解法ScharderS, dehmlow E V6用乙醛酸、尿素与苯酚作用生成对-羟基苯海因,再进行水解得目标化合物.其反应式为:此外还有一些合成方法,以苯酚、乙醛酸为原料,氨水7为氨化剂采用最优工艺合成了DL-HPG.以邻苯二甲酰亚胺8代替氨基磺酸,选用季铵盐十八烷基二甲基苄基氯化铵为相转移催化剂,产品收率可达83. 5%,纯度可达99%以上.反应条件温和、工艺简单,提高了产品收率和纯度,此工艺具有一定的工业推广价值.比较以上各种方法可以看出,由于乙醛酸、苯酚、氨基磺酸法具有步骤少、收率高、成本低等优点,从而得到了广泛应用. 2DL-HPG的拆分在拆分技术上

5、,近几年国内外常用的主要有化学拆分法和生物酶法.2. 1化学拆分法化学拆分法是广泛使用的一种方法.该法利用手性试剂与对羟基苯甘氨酸反应,生成两个非对映异构体,再利用两个非对映异构体的物理性质的不同将其拆分.最后把这两个非对映异构体分别复原为原来的对映体.以d-3-溴樟脑-8-磺酸铵盐9为拆分剂,在水杨醛存在下,使拆分和L-对羟基苯甘氨酸消旋同时进行,拆分外消旋对羟基苯甘氨酸得到阿莫西林等的侧链酸D-对羟基苯甘氨酸,总收率为70%,光学纯度99%.其反应式为:以DL-对羟基苯甘氨酸为原料,酯化后与D-酒石酸10成盐,利用D-型和L-型盐在甲醇中溶解度的不同,D-型盐先析出,经水解、中和得到D-对

6、羟基苯甘氨酸,总收率为61%.此法原料易得、工艺简单、成本低.在拆分体系中加入苯甲醛可直接将L-对羟基苯甘氨酸消旋重新拆分,能使步骤简化,收率有所提高.2. 2生物酶法生物酶法是当前国内外研究比较多的拆分方法,生物酶法具有光学活性单一、能源消耗少、“三废”污染小等优点.海因酶能选择性地将外消旋DL-对羟基苯海因中D型水解为N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG),残留L-对羟基苯海因在中性或碱性条件下,会迅速自发地消旋为DL-对羟基苯海因.因此,消旋的DL-对羟基苯海因最终接近于完全转化为D-HPG.酶拆分法包括一步酶一步化学法和二步酶法,前者是用海因酶将DL-HPG水解为NC-D-

7、HPG,再用化学法将其水解为D-HPG.随着N-氨甲酰水解酶在自然界中被发现,二步酶法生产D-HPG目前已成为研究的热点11.据文献报道:分离出来的Burkholderia cepaciaJS-0212、Sinorhizobium morelensS-513菌株能产生高活性的对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶,可以把对-羟基苯海因转化成D-对羟基苯甘氨酸.这样就省去了先合成外消旋混合物再拆分的繁琐步骤,可直接得到期望产物.3结语乙醛酸、苯酚、氨基磺酸法现已普遍应用在工业生产,具有步骤少、收率高、成本低等优点.随着拆分技术的发展,研发D-HPG的前景更好.为了实施绿色化学,倡导绿色合成,应注重不对

8、称合成技术的研究开发,利用不对称合成技术直接得到期望的化合物构型D-HPG,避免了繁琐的拆分,简化了后处理操作,也减轻了环保压力.其它文献：1 DHPG的合成化学合成是工业上生产DHPG 普遍采用的方法,但近年来,随着环保要求的不断提高和生物酶技术在手性氨基酸药物中的研究的不断进展,利用生物催化合成 DHPG 逐渐成为研究的热点 2 4。1. 1 生物催化合成法与化学合成方法相比, 生物催化法具有环境污染小、 反应条件温和、 选择性和转化率高等优点,但生物菌种的筛选较为困难, 投资大, 生物酶容易失活,无法大规模连续化生产。对于生物催化合成法的研究主要集中在利用D, L对羟基苯海因( D, L

9、HPH )为原料经酶催化合成DHPG 上。1. 1. 1 单酶法单酶法实际上分两步 5, 6, 第一步使用D海因酶( EC 3. 5. 2. 2)作用在底物D, LHPH 上,使其进行不对称开环生成N氨基甲酰D对羟基苯甘氨酸; 第二步再将 N氨基甲酰D对羟基苯甘氨酸用化学方法水解脱去氨甲酰基得DHPG。该方法的优点在于 D海因酶能选择性水解D H PH,而LH PH 在碱性条件下可以自发消旋为D, LHPH,底物的利用率达到100%, 但反应第二步采用化学方法水解,污染问题仍较为严重。1. 1. 2 两菌两酶法随着D氨基甲酰水解酶( EC 3. 5. 1) 的发现,使由D, LHPH 合成 D

10、HPG 的两菌两酶法得以实现 7, 8。培养用来提取D海因酶和D氨基甲酰水解酶适合的菌种是该法的关键( 见下式)。 许多菌种都可以用来提取D海因酶, 如土壤杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌, 根瘤农杆菌, 假单胞杆菌,大肠杆菌等 9 18。D 海因酶催化对羟基苯海因的反应一般在碱性缓冲溶液中进行, 反应的转化率较化学合成要高许多。Oliver Keil 等 9成功从嗜热菌种提取出 D海因酶, 该酶在 pH = 8. 5缓冲溶液中催化对羟基苯海因水解,反应温度70 ,转化率达75%以上; Chen 等 11从重组的大肠杆菌 BL21 ( DE3) 中提取出海因酶, 该酶在 40 , pH= 8. 5 的缓

11、冲溶液中进行催化反应, 对羟基苯海因的转化率达到了95%。游离的D 海因酶对环境敏感,活性一般只能持续一到两周时间, 容易失活,且反应完后无法回收, 无法重复使用,而酶的固载可克服这些缺点,因此成为近些年研究的重点 19 23。Jia 等 24用戊二醛活化的聚苯乙烯阴离子交换树脂对D海因酶进行固载, D海因酶中的氨基与戊二醛的醛基结合生成 Schif fbase, 使 D 海因酶更加稳定,提高了酶的活性。固载后酶的活性在 30 h 内没有变化, 100 d 后仍能保持 90%。D 氨基甲酰水解酶的寿命比 D 海因酶要短得多, 一般只能维持十几个小时, 但其催化活性高,反应的转化率往往达到100

12、% ,因此D氨基甲酰水解酶和它的固载方法的研究具有非常重要的意义 25 32。Chao 等 33对 D氨基甲酰水解酶carbamolyase CBL303 进行了固载, 其半衰期由17 h 提高到了210 h, 酶重复使用 16 次后, 底物的转化率仍能达到100%。1. 1. 3 一菌两酶法研究发现, 从某些菌种可以同时产生 D 海因酶和D氨基甲酰水解酶, 如假单胞菌、 土壤杆菌等,这使得原来两步的反应变为一步完成。Jiang等 34从菌种 Bur kholder ia cepacia JS02 中同时提取了D海因酶和D氨基甲酰水解酶,将其用于由对羟基苯海因水解制备对羟基苯甘氨酸的反应中取得

13、了很好的结果, D 对羟基苯甘氨酸的摩尔收率达94%。为了实现催化剂的重复使用, Arnaz 等 35, 36同样对一步反应中的 D海因酶和 D氨基甲酰水解酶的固载进行了研究。使用海藻酸盐对D海因酶和D 氨基甲酰水解酶进行包埋,固载后反应重复进行6 次, 酶的活力依然没有减弱,但反应的收率只有 50%。Arnaz 等 3 7对固载试剂进行了改进,使用海藻酸盐和壳聚糖的复合物对两种酶进行包埋, DHPG 的收率提高到 80%。导致收率明显下降的原因是 D海因酶的活性比 D 氨基甲酰水解酶高许多, 随着反应的进行,对羟基苯海因水解速度将大于N氨甲酰基D 对羟基苯甘氨酸的水解速度, 导致了中间产物N

14、氨甲酰基D对羟基苯甘氨酸的不断积累, 使反应的收率下降。为了解决上述问题, Liu 等 38和 Hiroy uki等 39分别对大肠杆菌的基因片段进行了重组,使得从重组的大肠杆菌提取的 D 海因酶和 D 氨基甲酰水解酶之间的活性差异减小, 减少了中间产物N氨甲酰基D对羟基苯甘氨酸的积累, 提高了收率( 95. 2%和98% )。1. 2 D HPG的化学合成方法化学合成因其具有生产工艺简单,易于操作等优点, 是目前中国工业化生产 DHPG 普遍采用的方法。方法是先制备 D, LHPG, 再对其进行拆分得到 DHPG。D, LHPG 合成方法主要有以下几种。1. 2. 1 对甲氧基苯甲醛法该法是

15、早期用于工业生产 D, LHPG 的合成方法。对甲氧基苯甲醛与氰化钠在水溶液或醇溶液中,经环合、 加压碱水解和脱甲基, 得到 D, LH该反应中使用剧毒的氰化钠, 反应路线长,收率低,碱水解步骤需要高压,对设备的要求条件较高,目前已经逐步被淘汰。1. 2. 2 对羟基苯甲醛法( Strecker 氨基酸合成法)Strecker 氨基酸合成法也是较早用于合成D, LH PG 的方法 4 0。即用对羟基苯甲醛与氰化物作用生成对羟基 氨基苯乙腈, 然后酸性水解成目标化合物,该法工艺较成熟, 收率较高,反应时间短,但使用的对羟基苯甲酸价格较高,也同样使用了剧毒的氰化物,生产中存在含 CN-的废水和HC

16、N 的处理问题,目前已经很少有厂家采用。 该法的关键是拆分剂的选择, 常用的拆分剂有:手性酒石酸,樟脑磺酸类等。以酒石酸为拆分剂,原料易得,成本低,但反应步骤长,单程转化率低(仅为50% ) ; 溴化樟脑磺酸的拆分效果好, 转化率也较高,单程转化率超过60%。2. 2 诱导结晶法本法利用氨基化合物的物理性质差异, 在外消旋体溶液中加入一种旋光异构体作为晶种, 诱导相同的异构体析出, 从而达到分离的目的 58 60。常用的拆分剂有: 手性酒石酸、 溴代樟脑磺酸、 苯磺酸、 硫酸等, 拆分路线如下:该法的优点是不使用昂贵的拆分剂, 并且利于回收和分离, 拆分母液可循环150 次以上, 消旋化母液可

17、连续套用。在拆分过程中选用合适的溶剂及配比,对投料量和温度严格控制,能取得较好的拆分效果, 旋光度可达 80% , 一步拆分收率可达90% , 降低了拆分成本。但是仍存在步骤多不能连续生产等问题。2. 3 离子自拆分法离子自拆分法是利用DHPG 自身作为拆分剂,在D对羟基苯甘氨酸硫酸氢盐的溶液中诱导结晶析出D对羟基苯甘氨酸硫酸盐, 再水解得DHPG 61。该法反应时间短,污染少, 成本低, 适于工业生产, 但反应中作为拆分剂的 DHPG 必须要有较高的光学纯度, 否则将直接影响到拆分产物的光学纯度。2. 4 不对称转化法不对称转化法是在醛类催化剂的作用下, 选用合适的拆分剂, 不需要分离出另一

18、种光学异构体,使消旋化和拆分在合适的溶剂中同步完成 62 65。该法省去了经典拆分中因对映体的浓度增加而导致的夹带现象,保证了光学纯度,拆分和消旋同步完成, 是近年来应用于氨基酸拆分领域的先进拆分技术之一。该法常用的拆分剂有溴代樟脑磺酸、 邻甲基苯磺酸、 磺基水扬酸、 苯基乙磺酸等。Yamada 等 62用苯基乙磺酸为拆分剂, DHPG 的收率为 79. 5%, 光学纯度为99. 8%。杨艺虹 6 5以甲基苯磺酸( T S) 为拆分剂, 以醋酸为溶剂,在苯甲醛的催化下制得DHPG TS 盐,然后再氨解得 D HPG, 总收率为77. 3%, 光学纯度为98. 9%。3 结 语乙醛酸,苯酚与铵盐

19、一步合成D, LH PG, 再经不对称转化拆分制备 DHPG 的方法原料易得,反应步骤少, 工艺简单, 适合工业化生产。但生物酶催化合成 D HPG 的选择性高, 污染小,反应条件温和,而且一酶双菌研究的不断进展,使得反应在一步内完成, 是工业化生产发展的方向。 其它类似主要拆分方法技术由于国内外大多是以对羟基苯甘氨酸得左旋体，所以研究该产品的拆分工艺尤为重要。在非手性环境中， 右消旋和左消旋的物理性质相同， 所以拆分难度大， 工艺过程复杂， 收率低， 通常利用一般方法不能将其分开， 常用的拆分法有以下几种。2.1 化学拆分法化学拆分法是利用光学活性剂与对羟基苯甘氨酸反应， 使之生成非对映异构

20、体， 再利用非对映异构体物理性质 （如溶解度、 蒸汽压、 吸收系数等） 的差异将其拆分9。原理如图6。本法的关键是拆分剂的选择，常用的有酒石酸、樟脑磺酸类、 苯磺酸等。以酒石酸为拆分剂， 原料易得， 成本低， 但反应步骤长， 单程转化率低 （仅 50） ；溴化樟脑磺酸的拆分效果好， 转化率也较高， 单程转化率超过 60； 苯磺酸这类非光学活性拆分剂， 易于回收， 成本较低， 具有较广阔的运用前景。2.2 酶拆分法自 20 世纪 90 年代以来， 国外普遍采用酶法拆分技术生产 D-p-HPG。该法是采用 DL- （） 对羟基苯海因在乙内酰脲酶的作用下进行不对称水解开环成 N-氨甲酰 -D-HPG

21、，再经过水解或氨甲酰水解酶得D-p-HPG 。其化学反应方程式如图 7。酶法工艺有一菌一酶法、 两菌两酶法和一菌双酶法， 其中以一菌双酶法为优。一菌双酶法是利用假单胞菌，在体内同时产生的乙内酰脲酶和氨甲酰水解酶，对 DL- 对羟基苯海因进行不对称开环得到 D- 对羟基苯甘氨酸。由于 DL- 对羟基苯海因水中溶解度低， 因此反应液体积较大， 反应速度慢， 可加入 10的助溶剂 DMSO， 以减少反应溶剂总体积， 也使转化速率增加， 酶转化率高达10010-12。酶法是最有竞争力的拆分技术， 现国内仅采用液相酶法生产 D-HPG。该法要解决易染菌及酶的活性匹配问题， 需利用基因工程技术进行基因改造

22、， 提高乙内酰脲酶的活性， 使乙内酰脲酶与氨甲酰水解酶的活性相匹配，解决反应过程中的中间体 N- 氨甲酰-D-HPG 滞留的问题， 缩短酶促反应时间。固相酶法是最有发展前景的生产技术， 由于固定化酶的来源和价格的问题， 国内未采用固定化酶技术生产 D-HPG。2.3 诱导结晶法诱导结晶法13是利用非对映异构体拆分剂盐的物理性质差异，进行分步拆分而得单一光学异构体。常用的拆分剂有手性酒石酸、樟脑磺酸、 3- 溴樟脑磺酸及非手性拆分剂。将消旋 DL-p-HPG 与拆分剂在含水醇溶剂中加热制成非对映异构体拆分剂盐的过饱和溶液，然后分别加入 D 或 L-HPG 拆分剂盐晶种， 逐步降温进行分步诱导析晶

23、，分别可获得 D 或 L- 异构体盐， L- 异构体盐经消旋化后重复拆分， D- 异构体盐进一步碱处理即得 D-HPG14。化学反应方程式如图 8。该法不必将 DL-p-HPG 制成衍生物，反应步骤减少， 一步拆分收率可达90， 降低了拆分成本。 但拆分操作比较繁琐， 在拆分过程中易夹带析出其他光学异构体， 应用于工业化大规模生产困难。2.4 不对称转换法不对称转换法是近年来应用于 - 氨基酸拆分领域先进的拆分技术， 可采用手性或非手性试剂作为拆分剂， 在醛类催化剂的作用下消旋化和拆分在合适的溶剂中可同步完成， 随着其中某一溶解性小的光学异构体不断析出， 来完成不对称转换过程， 获得高收率、

24、高光学纯度的单一光学异构体。蔡杨君等15先将 L-HPG 消旋得 DL-HPG， 采用(+)-1- 苯基乙磺酸(+)-PES)为拆分剂， 水杨醛为催化剂， 利用 L-HPG(+)-PES 盐在 20以下水中的溶解度是 D-HPG(+)-PES 盐的 80 倍的性质，先加热制成DL-HPG(+)-PES 盐的过饱和水溶液， 然后逐渐降温使形成的 D-HPG(+)-PES 盐很快从水中析出， 而 L-HPG(+)-PES 盐在热溶液中进行差相异构化，随着形成的D-HPG (+)-PES 盐不断析出而完成不对称转换过程，再用 6molL 的 NaOH 中和， 调节 pH 值至 5.5， 最终得到光学

25、纯度 98.3的 D-HPG， 转化率为 95.1。化学反应方程式如图 9。Bhattacharya 等 16用 D-3- 溴樟脑 -8- 磺酸(D-BCS)对 DL- 对羟基苯甘氨酸(DL-HPG)成盐， 经不对称转换制备 D-HPG。此实验是迄今为止最成功的应用实例。该法是以冰醋酸作为介质(加入少量醋酸酐除去所含的微量水)， 将 DL-HPG 与 D-BCS 成盐， 经水杨醛催化发生不对称转换， 反应后的浆状物经过滤得到 99.9的 D-HPG D-BCS 盐，转化率达到 99。D-HPGD-BCS 盐在甲醇介质中中和即得到 D-HPG， 光学纯度 99.99， D-HPG 制备总收率为

26、93.06。母液中加入等量冰醋酸， 蒸去甲醇后所得的 D-BCS 醋酸溶液可循环套用。李庆文等17先将 DL-HPG 酯化， 与 D- 酒石酸成盐， 在芳香醛(苯甲醛、 水杨醛等)催化下进行不对称转换，经沉淀、水解、中和得到 D-HPG，总收率为60.76。该法优点是工艺条件温和， 缺点是多了甲酯化和酯水解反应， 收率较低。以上手性试剂拆分 DL-HPG 效果虽好，但价格昂贵， 来源困难。 Hongo 等22对不对称转换进行了深入研究，选用了价廉易得的非手性拆分剂邻甲苯磺酸(O-TS) 进行拆分，获得较满意的结果。该方法是将DL-HPG 和 O-TS 成盐， 溶解在冰醋酸介质里， 向体系中加入

27、 DL-HPG、 O-TS、 少量水杨醛以及少量 D-HPG O-TS作晶种， 加热搅拌数小时后得到一浆状混合物， 过滤得到单一的 D-HPGO-TS 盐， 旋光纯度 97.4 ， 转化率 81。D-HPGO-TS 经重结晶和 NaOH 水解得到光学纯度 99.5的 D-HPG， 拆分母液的 DL-HPGO-TS 可连溶剂循环使用。加入适量的 DL-HPG 和 O-TS 可适当提高外消旋化速度。 D-对羟基苯甘氨酸的不对称转化拆分D - 对羟基苯甘氨酸( 1 ) 是合成阿莫西林(amoxicillin)、头孢羟氨苄(cefadroxil)的重要侧链待添加的隐藏文字内容3酸，国内外医药市场用量较

28、大1。国内的生产方法是先得到DL-对羟基苯甘氨酸(DL-HPG，2)，再用优先结晶法进行拆分得到1，产率较低 25。文献6以d-3-溴樟脑-8-磺酸铵盐(d-ABCS)为拆分剂，经不对称转化得到光学纯度较高的D-型对映体拆分盐(3)，再经碱化得到1(图1)。此法可使过饱和体系中光学异构体的分步结晶和L-型对映异构体的消旋化相结合，使结晶拆分和消旋化 “一锅”进行， 提高了L-型对映体的利用率，拆分效率较传统的优先结晶法大大提高，总收率487,8。按文献6操作时发现3的重结晶损失较大，该步得率仅52，且碱化产物的光学纯度不佳。本研究对3不经重结晶直接用碳酸钠碱化，然后用等电点法提纯， 并进行了对

29、比试验， 确定了最佳加料顺序和反应时间、 温度等条件。 改进后的拆分单程收率可达98以上。提纯后的1光学纯度99以上。反应总收率70。实验部分；D-型对映体拆分盐D-HPG/d-BCS(3)2(10g，59.9mmol)和d-ABCS(20g，60.9mmol)加至乙酸(100ml)中，依次加入1mol/L硫酸的乙酸溶液(25ml)和水杨醛(0.3ml)，搅拌升温至70后缓慢加入1mol/L硫酸的乙酸溶液( 5ml)和乙酸酐0.8ml)。加毕同温反应22h。反应毕降至室温，过滤， 滤饼用少量乙酸洗涤， 减压干燥， 得白色固体(28.2g，98.6)，mp 240242， aD20 2.5c 1

30、, 1mol/L盐酸)。D-对羟基苯甘氨酸(1)3(10g，20.9mmol)和碳酸钠(1.1g，10.5mmol)加至甲醇(40ml)中，搅拌升温至60回流反应2h。反应毕降至室温，过滤，滤饼用热甲醇洗涤，干燥得到粗品1(3.48g，99.8)， aD20106.1(c 1，1mol/L盐酸)，光学纯度67。滤液和洗液合并，用于拆分剂回收套用。粗品1( 10g，59.9mmol)热溶于1mol /L盐酸(25ml)。用2活性炭脱色( 90，30min)，过滤，滤液用25氨水缓慢调至pH 6，过滤，滤饼用少量水洗涤，干燥后得白色晶体1(7g，70)，mp 2 25226(分解)， a D201

31、57.9( c 1，1mol/L盐酸)，光学纯度99。拆分剂的回收套用如上所得拆分盐的碱化滤液和洗液合并( 约60ml)，蒸除溶剂，得d -3 - 溴樟脑-8 - 磺酸钠盐(17.8g，53.3mmol)，继和2(8.8g，52.4mmol)进行拆分反应，得白色固体3(24.5g，97.9)，碱化得到粗品1(8.5g，98.7)，纯化后得白色纯品1(6g，70.4)， aD20154.7(c 1，1mol /L盐酸)。总收率70，1 光学纯度97.9手性流动相HPLC法拆分对羟基苯甘氨酸对映体的研究摘 要: 将 环糊精、羟丙基 环糊精作为手性流动相添加剂, 系统地研究了D,L 对羟基苯甘氨酸在

32、RP HPLC 系统中的拆分。分别考察了手性流动相的种类, 手性试剂 环糊精的浓度, 流动相的pH, 修饰剂的种类及浓度, 色谱柱温度等对拆分效果的影响, 以 CD 为手性流动相添加剂, 建立了 CD 手性流动相分离对羟基苯甘氨酸对映体的方法。结果表明: 用ODS 柱( 250 mm 4. 6 mmi. d. ) , 以 V( 甲醇环糊精) V( pH 45 磷酸盐缓冲液) = 30 70 为流动相, 流速02 mL min, 柱温25 ! , 检测波长为230 nm时对羟基苯甘氨酸对映体得到了良好的基线分离, 分离度可达1. 71。关键词: 高效液相色谱法; 手性流动相; 对羟基苯甘氨酸;

33、对映体拆分; 环糊精中图分类号: O657. 7 文献标识码: A 文章编号: 1000 0720( 2008) 02 070 03 对羟基苯甘氨酸是一类重要的医药、化工中间体。其结构式见图1。分子中含有一个手性碳,其中D 一对羟基苯甘氨酸 ( D pHPG) , 化学名D 氨基对羟基苯乙酸, 是一种重要的医药中间体,主要用作半合成青霉素和半合成头孢菌素类药物的侧链化合物 1。D对羟基苯甘氨酸也应用于感光领域和用作铁、磷、硅等的分析试剂等2。D对羟基苯甘氨酸是一种很有市场前景的精细化工中间体, 研究对羟基苯甘氨酸的液相色谱手性拆分技术对于产品质量控制具有重要的意义,目前未见文献报道关于对羟基苯

34、甘氨酸的液相色谱拆分分析方法。 环糊精作为手性流动相添加剂分离手性药物已经成功的分离了许多手性药物 3 5。本文采用了 环糊精( CD) 作为手性流动相添加剂, 以反相 C1 8柱为固定相, 用HPLC 法对对羟基苯甘氨酸消旋体进行了系统的拆分研究。考察了手性试剂的种类和浓度, 流动相的pH, 流速, 修饰剂的种类及浓度, 色谱柱温度等对拆分效果的影响, 建立了 CD 手性流动相高效液相色谱拆分对羟基苯甘氨酸对映体的方法。 1. 2 实验方法实验中所用样品溶液为001 mg mL 对羟基苯甘氨酸30%甲醇溶液, 进样前用0. 45 m微孔滤膜过滤。色谱条件: 岛津色谱柱( 250 mm 4.

35、6 mmi. d. , 5 m) , 以 V( 甲醇) V( 80 mmol L 环糊精pH 45 磷酸盐缓冲液) = 30 70 为流动相, 流速02 mL min, 柱温: 25 ! , 进样量5 L, 在230 nm处检测。2 结果与讨论2. 1 手性添加剂类型的选择分别考察了 环糊精和羟丙基 环糊精作为手性添加剂对拆分的影响, 结果见图 2, 其中( a)的流动相添加剂为羟丙基 环糊精, ( b)的流动相添加剂为 环糊精, 按 12 节色谱条件由图可以得出: 环糊精作为流动相添加剂对对羟基苯甘氨酸对映体拆分有效, 在同样实验条件下, 羟丙基 环糊精作为添加剂对拆分无效, 故选择 环糊精

36、作为流动相添加剂。氨酸对映体拆分的影响很大, 用乙腈作有机修饰剂时, 对羟基苯甘氨酸对映体不能达到基线分离而用甲醇和四氢呋喃时可以达到基线分离, 但是用四氢呋喃作流动相基线不容易走平, 并且易损柱接头。实验过程中选择甲醇作为有机溶剂修饰剂较合适。2. 3 流动相中 CD浓度对拆分的影响比较含不同浓度 CD 的流动相分离结果可知, 随着 CD 浓度的提高, 分离度增大, 当浓度是6 mmol L 时, 按 12 节色谱条件得到如图3 所示的分离效果。当 CD 浓度达到8 mmol L 时, 分离度已达到 1. 71, 可以达到分离要求。但是 CD浓度过高, 会导致色谱柱内压力过大, 堵塞流路,缩

37、短色谱柱寿命。因此, 选用8. 0 mmol L 浓度的 CD较为合适, 得到的色谱分见图2( b) 。2. 4 流动相pH 对拆分效果的影响对羟基苯甘氨酸为弱酸性化合物, 减小酸度通常有利于酸性化合物的离解。其它条件不变,考察流动相pH 对分离度的影响。用 2 mol L KOH溶液调pH, 配制不同浓度的磷酸盐缓冲液拆分对羟基苯甘氨酸对映体, 表 1 所示实验结果表明pH 45时, 拆分效果最好。2. 5 柱温对拆分的影响分别考察了柱温为20、25、30、35、40 ! 时的拆分效果。温度提高, 分离度降低, 但是温度太低使保留时间延长, 并且 CD 容易在色谱柱中析出造成色谱柱堵塞, 试

38、验中在25 ! 下进行分离, 能够保证良好的分离效果。2. 6 流速的影响在以上各项HPLC 条件优化后, 考察了流动相流速的影响。实验数据表明, 低流速分离效果较好, 原因可能是高的流速会降低形成复合物的能力, 导致分离度变差, 但是流速太低又会导致柱效变差。综合两方面因素影响, 本实验采取 0. 2mL min 的流速, 分离度可以达到 1. 71, 同时理论塔板数按 对羟基苯甘氨酸计算为 按 对羟基苯甘氨酸计算为1025。3 结论建立了手性流动相添加剂法拆分对羟基苯甘氨酸对映体, 分离因子可达171。通过实验得到的最佳色谱分离条件为: 岛津色谱柱( 250 mm 46 mm, 5 m)

39、, 以 V( 甲醇) V( 80 mmol L 环糊精pH 45 磷酸盐缓冲液) = 30 70 为流动相, 流速02 mL min, 柱温: 25 ! , 进样量5 L, 在230 nm处检测。本方法立体选择性高、重现性好、保留时间适中, 可用于对羟基苯甘氨酸旋光体的测试。 正交试验优化 DL- 对羟基苯甘氨酸合成工艺DL-对羟基苯甘氨酸简称 DL-HPG，是一种重要的医药中间体 该化合物经拆分后可得 D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG），主要用于合成广谱抗生素羟氨苄青霉素和羟氨苄头孢 头孢哌酮 头孢罗奇及头孢羟胺唑等；也可用在感光领域和用作铁 磷 硅等的分析试剂 同时，这类氨基酸化合物及其衍生

40、物在抗微生物 抗病毒等领域具有广阔的前景 其合成受到温度 反应时间 溶液 pH值及原料比等很多因素的影响 而正交试验法是一种研究多因素影响的有效方法, 在科研中被广泛采用1，但其在 DL-HPG 合成中的应用, 文献报道较少 本实验采用 L16 （4） 5正交试验研究各因素对 DL-HPG 合成的影响, 从而找出最佳的合成工艺条件 1 试验部分1.1 主要试剂焦化苯酚来自本公司酚蒸馏装置，含量在 99以上；乙醛酸为市售 40水溶液，胺化剂如乙酸铵氨基磺酸 氨基甲酸铵 氨水 二氯甲烷等为市售分析纯1.3 正交实验设计在采用乙醛酸 苯酚与铵盐或活泼酰胺基化合物直接反应法合成DL-对羟基苯甘氨酸的基

41、础上（见图1），为了确定反应的最佳工艺条件，选用四水平五因素的正交实验表（表头设计见表 1），特针对一些影响DL-对羟基苯甘氨酸收率的主要因素如反应物投料摩尔比 反应温度 反应时间 催化剂的量 胺化剂种类等做了大量的实验，并借此确定DL-对羟基苯甘氨酸合成的最佳工艺方案1.4 试验过程在装有搅拌器 温度计和回流冷凝器的四口烧瓶中称取一定量的乙醛酸加入，水浴升温到设定温度后，搅拌下加入胺化剂，并加入一定量的水作为溶剂 待物料升温到设定温度后，搅拌 15 min；通入N2保护，将苯酚水溶液通过恒压滴液漏斗滴入，控制反应温度波动不超过 1 ，反应5 h 后加入催化剂，升温5 再反应3 h 反应结束后

42、，将反应液移至分液漏斗中，加入二氯甲烷萃取过量的苯酚，然后往萃余液滴加盐酸调节 pH值为 5.5 后，在 05 冷却数小时后过滤，用水洗涤至滤液无色。 得到的乳白色固体即为DL-HPG，将固体放入真空干燥器中干燥后称重，经液相色谱分析纯度后计算得率2.3 各反应因素的影响与最佳方案的选择在苯酚 /乙醛酸 1.61 后，产率没有明显的提高。 而温度的较适宜区域是60 附近，温度升高虽然有利于加速反应，但易引起苯酚的氧化而降低产品得率，实验中也可以看出温度超过80 后，反应液的颜色明显加深而呈现褐色。总的反应时间在 400500 min 的区间为宜。结合极差和方差的分析结果，在确定最佳方案时，对重要因素胺化剂选最佳水平，对次要因素如苯酚的投料比，本着节约和方便的原则确定水平，确定出最佳方案A2B3C3D2E1，将该组合方案重复三次实验，产率在65% 67之间，具有良好 的重现性，比A3B2C4D3E1 的方案要高出 2%3，并且节省了原料和时间3 结论通过 L16 （4） 5正交试验的方法对一步法合成DL-对羟基苯甘氨酸的工艺进行优化，找到了反应的主要影响因素和最佳工艺条件：反应投料摩尔比（苯酚 乙醛酸）1.2 1，反应温度 60 ，反应时间400 min，催化剂用量6，胺化剂为氨水 试验的方差结果表明，催化剂的量和胺化剂是反应的主要影响因素。