4762.赤芍中芍药苷的提取工艺研究 论文正文.doc

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1、毕 业 论 文（设计）题 目赤芍中芍药苷的提取工艺研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010年5月3 0日摘要本论文研究了赤芍中的芍药苷的提取与精制工艺，通过考察芍药苷的纯度和回收率，对提取和精制芍药苷的工艺进行了优化。结果表明采用70%乙醇回流提取3次，再依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种溶剂萃取，用硅胶柱层析进行纯化，纯化操作条件为氯仿-甲醇8:1、床层高度与直径比为18.5、负载量为20.7mg/g硅胶。使用该工艺可从赤芍中得到纯度大于97.0%的芍药苷产品，总回收率超过87.0%。关键词：赤芍；芍药苷；正丁醇；HPLC 目 录引言. 11材料与方法.1

2、1.1实验材料.11.2实验试剂.11.3实验仪器.21.4试验方法.21.4.1分析方法.21.4.1.1 TCL分析方法.21.4.1.2 HPLC定量 .21.4.2提取工艺流程. .31.4.3提取和纯化方法.32结果分析.42.1回流提取过程中的芍药苷提取情况.42.2萃取过程中的芍药苷提取情况.52.3纯化过程中的芍药苷情况.52.3.1 DA-201大孔吸附树脂的纯化情况.52.3.2 D-101大孔吸附树脂的纯化情况. . .52.3.3 硅胶的纯化情况 . . . . . . .63结论. . . .74展望.7参考文献.8引言芍药苷为赤芍的主要药效成分，具有镇静、镇痛、解痉

3、、解毒、抗炎、抗过敏、血管扩张等药理活性，并有活血、化瘀、补阴等功效1,2。芍药苷为白色粉末，mp.172C，分子式C23H28O11，是一种蒎烷单萜苷3，在碱性溶液中不稳定，产生一定量的苯甲酸，放置后部分变成红棕色树脂物质，遇硫酸显紫褐色，紫外灯(254nm)下显暗斑。国内外对赤芍的化学成分和药材的溶剂提取进行了较多的研究4。从赤芍中提取芍药苷工艺过程的研究都是以提取少量样品用于鉴定、分析、药理研究为目的，因此过程较繁杂，且未对制备过程中芍药苷的回收率进行考察5。为了更好地利用赤芍资源，本论文通过考察芍药苷的纯度和回收率，对提取和精制芍药苷的工艺进行了优化。本论文的研究结果对芍药苷的大规模制

4、备有一定的指导意义。1 材料与方法1.1实验材料 赤芍药材，产于购自河北安国药材市场，经浙江中医药大学陈孔荣教授鉴定符合2005版中国药典对赤芍的要求。饮片厚度小于6mm6。参考中国药典2005版的测定方法对药材中芍药苷的含量进行了分析，结果为5.2%（wt）。1.2实验试剂 正丁醇（AR，杭州大方化学试剂厂）。芍药苷对照品：中国药品生物制品检定所。硅胶：100-200目，青岛海洋化工厂分厂甲醇（色谱纯，merck公司）石油醚、甲醇等其它有机溶剂均为分析纯。D201大孔吸附树脂1.3实验仪器Agilent1100高效液相色谱仪（含G1354A四元梯度洗脱泵；G1322A在线脱气装置；G1313

5、A自动进样器，UV-Vis检测器，G1316A柱温箱），Aginlent1100色谱工作站；Diamonsil C18柱（2504.6mm，5m；Dikma）电子分析天平（梅特勒. 托利多仪器上海有限公司）架盘药物天平：马头牌BP-II型，称量范围0.5g-500g，上海医用激光仪器厂。蛇形冷凝管加热套：TC-15套式恒温器，控温范围50-200，浙江新医疗器械厂。500mL圆底烧瓶；50mL容量瓶；1000mL的分液漏斗旋转蒸发仪1.4 实验方法1.4.1分析方法1.4.1.1 TLC定性方法硅胶GF254板，以氯仿-甲醇（5:1）为展开剂，紫外显色（254nm），芍药苷的比移值Rf为0.3

6、6。1.4.1.2 HPLC定量 色谱条件：色谱柱为Diamonsil-C18柱（250 mm4.6mm，5m，迪马公司），流动相为甲醇:水（40:60），流速1.0mL/min，柱温30，检测UV 230nm7,8。芍药苷的典型HPLC分析结果如图1.1所示。芍药苷图1.1芍药苷的典型HPLC分析结果对照品溶液的配制：精确称取9.4mg芍药甙对照品，置于50mL容量瓶，用甲醇稀释到刻度，得到0.188mg/mL芍药甙对照品溶液9,10。线性关系考察：将配置好的芍药苷对照品溶液依次进样2，4，8，12，16，20L，芍药苷的回归方程为Y6.4368+1370.4773X，r=0.9999，其中

7、X为进样量（g），Y为峰面积（mAUs）。结果表明芍药苷在0.3763.76g呈良好的线形关系。1.4.2提取工艺流程采用的工艺路线如图1.2所示，本工艺主要包括醇水溶液回流提取、液液分配、柱层析等工序，其中柱层析是本工艺的关键。赤芍饮片醇水溶液回流提取真空浓缩T60液液分配真空浓缩T60柱层析真空浓缩T50芍药苷产品图1.2 芍药苷提取工艺路线1.4.3 提取和纯化方法赤芍饮片700g（芍药苷含量为5.2%）用70%乙醇回流提取3次，每次的溶剂用量分别为4100mL、3500mL和3500mL，回流时间分别为2.0h、1.5h和1.5h。合并提取液，过滤，滤液在60以下真空浓缩至糖浆状的浸膏

8、，称重后分析芍药苷含量。将浸膏采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种溶剂依次萃取11。每次500mL。萃取后的水相用乙酸乙酯萃取2次，每次500mL。乙酸乙酯萃取后的水相用正丁醇萃取3次，每次500mL，合并3次萃取的正丁醇溶液，在60以下真空浓缩得膏状物称重，并分析膏状物中的芍药苷的含量。提取后的膏状物分别用DA-201大孔吸附树脂、D-101大孔吸附树脂、硅胶柱层析进行芍药苷的纯化工艺研究。对DA-201大孔吸附树脂的具体纯化方法如下：采用内径19.8mm的自制层析柱，床层高度39cm。正丁醇萃取所得的膏状物配成0.396g/mL的水溶液，上样10mL，用水作洗脱剂洗脱，分瓶收集流出液，用TLC

9、定性，合并含芍药苷的39瓶收集部分，减压浓缩至干得到浅黄色固体称重，用甲醇溶解，采用HPLC定量分析芍药苷的纯度和回收率。对D-101大孔吸附树脂的具体纯化方法如下：柱内径19.8mm，床层高度39cm。正丁醇萃取所得的膏状物配成0.396g/mL的水溶液，上样10mL，分瓶收集流出液，用TLC定性。分别考察20%、30%、95%的乙醇洗脱对分离的影响，在加不同浓度的乙醇前，先用蒸馏水洗至洗脱液的芍药苷的显色反应成无色。测定洗脱液中的芍药苷的含量并合并含芍药苷的39瓶收集部分，减压浓缩至干得到浅黄色固体称重，用甲醇溶解，采用HPLC定量分析芍药苷的纯度和回收率。对硅胶柱层析的具体纯化方法如下：

10、采用内径30mm的自制层析柱，床层高度555mm（床层体积392mL）。操作过程如下：硅胶用氯仿充分浸泡，脱气后，用湿法装柱。每克正丁醇萃取所得的膏状物用10mL洗脱剂溶解后上柱，再用洗脱剂洗脱（氯仿-甲醇混合溶液），分瓶收集流出液，用TLC定性，合并含芍药苷的部分，减压浓缩至干，称量后用甲醇溶解，经HPLC定量分析。2 结果与分析2.1回流提取过程中的芍药苷提取情况700g赤芍饮片提取得到的糖浆状浸膏共297.8g。经HPLC分析，浸膏中芍药苷的含量为11.9%。回流提取工艺芍药苷的回收率为98.2%，可见采用70%乙醇回流提取3次能把赤芍中的芍药苷基本提取完全。2.2萃取过程中的芍药苷提取

11、情况液液分配的目的是将浸膏中的部分杂质除去，使芍药苷得到初步纯化。液液分配的关键在于选用合适的溶剂。采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，最后用正丁醇萃取浓缩后得膏状物106.6g。经HPLC分析，正丁醇萃取所得膏状物中芍药苷的含量为31.6%。萃取过程中芍药苷的回收率为95.3%。经过液液萃取后可使芍药苷的含量由11.9%提高到31.6%，且芍药苷的损失只有4.7。2.3纯化过程中的芍药苷情况2.3.1 DA-201大孔吸附树脂的纯化情况DA-201大孔吸附树脂的纯化结果见表2.1。合并含芍药苷的39瓶收集部分，减压浓缩至干得到浅黄色固体1.929g，用甲醇溶解，经HPLC定量分析，芍药苷的

12、纯度为58.8%，回收率90.5%。由此可见，DA-201大孔吸附树脂对芍药苷的吸附很弱，用水就可以把芍药苷洗脱下来，故DA-201大孔吸附树脂不适宜作分离高纯度芍药苷的固定相。表2.1 DA-201用水洗脱的洗脱液体积和颜色表瓶 号12345678910体积（mL）45422825353531393734芍药苷检测无无有有有有有有有无2.3.2 D-101大孔吸附树脂的纯化情况采用不同浓度的乙醇进行洗脱，D-101大孔吸附树脂的纯化结果见图2.1，流动相组成对柱层析分离过程的影响如表2.2所示，表中洗脱体积为芍药苷全部洗脱出时收集到的洗脱液的体积（不包括开始用水冲洗的体积）。从表2.2可见，

13、随着乙醇浓度的增加，芍药苷纯度和洗脱体积显著下降，回收率增加。但即使采用20%乙醇洗脱，产品纯度也只有80.0%。D-101的纯化效果也不是很理想。图2.1 不同乙醇浓度的洗脱曲线表2.2 乙醇浓度对柱层析分离过程的影响乙醇浓度20%30%95%纯 度80.0%62.2%52.7%回 收 率91.2%96.6%99.1%洗脱体积（mL）7113742172.3.3 硅胶的纯化情况从表2.3可见，随着流动相中甲醇含量的增加，产品纯度和洗脱体积显著下降，产品回收率增加。当氯仿-甲醇体积比为8:1时，既能保证一次性过柱产品纯度大于97.0%，又能达到使用较少洗脱液的目的（约为4.7个床层体积）。表2

14、.3流动相组成对柱层析分离过程的影响氯仿-甲醇(体积比)10:18:16:14:1纯 度98.0%97.6%93.0%91.7%回 收 率92.3%93.0%96.4%99.8%洗脱体积（mL）294318531560734在流动相氯仿-甲醇体积比8:1下，对负载量对分离结果的影响进行了实验，结果如表2.4所示。从表可见，随着进料量的增加，产品纯度下降，而回收率却显著上升。如果要求通过一次柱层析达到97.0%以上的产品，不能有很高的负载量，合适的负载量为20.7mg/g硅胶。回收率上升的原因可能是硅胶对芍药苷有一定的吸附，每克硅胶的吸附量为一定值，与进样量关系不大引起的。表2.4负载量的优化结

15、果负载量（mg正丁醇浓缩样品/g硅胶）10.320.731.062.0纯 度97.8%97.6%95.9%91.5%回 收 率92.7%93.0%94.5%98.5%3结论本论文提出了一条从赤芍中提取芍药苷的工艺，该工艺包括醇水溶液回流提取、液液分配、柱层析等工序。具体如下：赤芍饮片700g（芍药苷含量为5.2%）用70%乙醇回流提取3次，每次的溶剂用量分别为4100mL、3500mL和3500mL，回流时间分别为2.0h、1.5h和1.5h。合并提取液，过滤，滤液在60以下真空浓缩至糖浆状的浸膏。将浸膏采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种溶剂依次萃取。每次500mL。萃取后的水相用乙酸乙酯萃取2

16、次，每次500mL。乙酸乙酯萃取后的水相用正丁醇萃取3次，每次500mL，合并3次萃取的正丁醇溶液，在60以下真空浓缩得膏状物。再将膏状物用硅胶柱层析进行纯化，纯化操作条件为流动相氯仿-甲醇8:1、床层高度与直径比为18.5、负载量为20.7mg/g硅胶。使用该工艺可从赤芍中得到纯度大于97.0%的芍药苷产品，总回收率超过87.0%。4 展望利用二次（或多次）柱层析和增加负载量等措施，有可能进一步降低柱层析的成本。通过多次柱层析可制备纯度大于99.0%的芍药苷产品。参考文献1 国家药典委员会. 中国药典, 部S. 北京: 化学工业出版社, 2000: 125. 2 袁昌齐主编. 天然药物资源开

17、发利用M. 南京: 江苏科学技术出版社, 2000. 103-105.3 徐红梅, 刘青云, 戴敏等. 赤芍总甙抗血栓作用研究J. 安徽中医学院学报, 2000, 19 (1): 46-47.4 邵长风, 陈坚, 杨吉田等. 中药止痛胶囊中芍药苷的HPLC含量测定J. 中草药, 1999, 30 (11): 822-823.5 杨玉华, 陈燕均. 古汉养生精片中芍药苷的含量J. 中国中药杂志, 1997, 22 (2): 165-166.6 郭春燕, 张万明, 王治宝等. HPLC法测定桃红四物汤中芍药苷和梓醇的含量. J 中草药, 2004, 35 (7): 756.7 朱晓军, 陈彬, 方强等. 高效液相色谱法测定精制冠心颗粒中芍药苷含量J. 医药导报, 2006 (8): 826-827.8 林伟忠. 白芍及其复方制剂中芍药苷测定方法研究J. 中成药, 1997 (6): 43-44.9 李矗, 王汀, 王珍. 高效液相色谱法测定赤勺中赤勺总苷的含量J. 安徽医药, 2005 (11): 820-821.10 赵永德, 丁昌成, 贾善学. RP-HPLC法测定胃肠舒片中芍药苷的含量J. 中国药师, 2005 (12): 1007-1008.11 中华人民共和国卫生部部颁标准. WS3-B-0614-91调经活血片质量标准S. 1991: 150.