高效液相色谱法测定发酵食品中组胺的含量.doc

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1、高效液相色谱法测定发酵食品中组胺的含量粮油食品科技第20卷2012年第2期质量控制高效液相色谱法测定发酵食品中组胺的含量肖琴,王充,郑琳,谭炳炎(1.中山大学公共卫生学院,广东广州510080;2.广东食品药品职业学院实验实训中心,广东广州510520)摘要:建立了柱前衍生一高效液相色谱分析食品中组胺含量的方法,通过对广州市售不同品牌的大豆发酵制品,酸奶和啤酒中组胺含量的测定,对各种食品的组胺含量有一个初步的了解,为保障食品安全提供技术依据.检测结果为豆豉中组胺平均浓度为464.28mg/kg,豆酱为481.50mg/kg,酱油为461.78mg/L,三类大豆发酵制品组胺浓度平均值没有明显区别

2、;酸奶样品中组胺平均含量为312.15mg/kg;啤酒样品中组胺平均含量为2.36mg/L.广州市售的大豆发酵制品,酸奶和啤酒中均有组胺检出,其中大豆发酵制品中组胺含量普遍较高.关键词:高效液相色谱;发酵食品;组胺中图分类号:R155.5文献标识码:A文章编号:10077561【2012)02003103DeterminationofhistamineinthefermentedfoodbyHPLCXIAOQin,WANGChong,ZHENGLin,TANBingyan(1.CollegeofPublicHealth,SunYatsenUniversity,GuangzhouGuangdon

3、g510080;2.ExperimentandTrainingCenter,GuangdongFoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou,Guangdong510520)Abstract:ThehistaminecontentinthefoodinGuangzhoumarket,includefermentedsoybeanproducts,yogurtandbeer,wasdeterminedbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC)withprecolumnderivatization.Theresultssho

4、wedthattheaverageconcentrationofhistaminewas464.28mg/kginlob?stersauce,481.50ms/kginsoybeanpaste,and461.78mg/Linsoysauce.Thethreekindsoffermentedsoybeanproductshavealmostthesameconcentrationofhistamine.Theaverageconcentrationofhistaminewas312.15mg/kgintheyogurtsample,and2.36mg/Linthebeersample.Hista

5、minewasfoundinthefermentedsoybeanproducts,yoguaandbeersamplesfromGuangzhoumarket,andtherewasahighconcentrationofhistamineinthefermentedsoybeanproducts.Keywords:highperformanceliquidchromatography(HPLC);fermentedfood;histamine生物胺是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称.可以看作是氨分子中13个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质,是脂肪族,酯环族或杂环族的低分子

6、量有机碱,常存在于动植物体内及食品中.生物胺引起的食品安全问题,也就是生物胺的毒性作用.其中组胺对人类健康的影响最大,其次是酪胺J.除了组胺,酪胺本身的作用外,其他生物胺的存在会增强组胺和酪胺的不良作用.高效液相色谱具有分析速度快,柱效高,检测灵收稿日期:20110429作者简介:肖琴(1979一),女,湖北宜昌人,博士,讲师敏度高,定量分析准确的特点,是目前食品中生物胺含量分析测定的主要手段_3I4J.生物胺分子中缺少发色基团,本身既无紫外吸收,又无荧光及电化学活性.为了提高检测的灵敏度及其响应,必须衍生后才能检测.邻苯二甲醛和丹磺酰氯是目前最常用的生物胺衍生试剂.邻苯二甲醛常被作为柱后衍生

7、试剂.丹磺酰氯作为液相色谱柱前衍生试剂具有衍生操作简单,衍生物稳定性好,可定量完成磺酰化反应,有较强的荧光和紫外吸收,灵敏度高,反应范围宽,基体干扰不明显等优点,所以成为了生物胺高效圆质量控制粮油食品科技第20卷2012年第2期液相色谱检测中应用最多的柱前衍生试剂-7.本文以丹酰氯为衍生试剂,采用柱前衍生一高效液相色谱法来分析食品中组胺的含量,通过对广州市售不同品牌的大豆发酵制品(豆豉,豆酱和酱油),酸奶和啤酒中组胺含量的测定,对各种食品的组胺含量有一个初步的了解,为保障食品安全提供技术依据.1材料与方法1.1仪器与试剂美国Biorad700高效液相色谱仪,1706uV紫外检测器,分析天平,恒

8、温水浴箱,均质机,离心机,0.45m针头微孔滤膜过滤器等.组胺标准品由广东省疾病预防控制中心提供,纯度>99%.氨水(25%),碳酸氢钠,高氯酸,氢氧化钠,丹酰氯均为分析纯,甲醇,丙酮和乙腈均为色谱纯,实验用水均为双蒸水,并经MilliQ超纯处理.溶液配制:称取一定量的组胺标准品,用0.4mol/L高氯酸配制成浓度为1mg/mL的组胺标准溶液,放于冰箱中4保存,一周一配.精确称取适量丹磺酰氯,用丙酮溶解并配制成浓度为10mg/mL的溶液,经过0.45m针头微孔滤膜过滤器过滤后,4冰箱中保存,备用.1.2样品采集与处理于广州市某大型超市购买具有相近生产日期,不同品牌的大豆发酵酱油,豆酱各三

9、种,盒装及散装豆豉各一种,酸奶六种,啤酒(易拉罐装)五种.豆豉和豆酱分别取出适量,于研钵中捣碎,混匀,酸奶和酱油摇匀.准确称取2.0g豆豉或豆酱样品(酸奶5.0g,酱油2.0mL),置于15mL离心管中,加入10mL0.4mol/L高氯酸,并用均质机捣碎,混匀,在3000r/min的条件下离心10min;取出上层清液,再次加入10mL0.4mol/L高氯酸,充分混匀,在3000r/min的条件下离心10min;取出上层清液,合并两次清液并过滤,用0.4mol/L的高氯酸定容到25mL.取啤酒样品20mL于小烧杯,室温超声脱气20min.准确量取5mL于15mL离心管中,加入2.5g氯化钠,振荡

10、使之溶解并达到饱和,再加人3mL正丁醇一氯仿(体积比50:50)溶液,加盖旋紧,充分振荡10min,于3000r/min条件下离心10min,取上层清液2mL于离心管中,于4O水浴条件下氮气吹干后,再加入0.1mol/L盐酸0.5mL.1.3柱前衍生取样品提取液0.25mL,加入25L2mol/L的氢氧化钠调节pH值,加入75饱和碳酸氢钠溶液和0.5mL10mg/mL丹酰氯一丙酮溶液,摇匀,于40cC水浴下避光反应45rain;反应毕,取出加入2525%的浓氨水,静置30rain,用乙腈定容至1.25mL,振荡混匀.将衍生后溶液用0.45m针头微孔滤膜过滤器过滤,用高效液相色谱测定.1.4色谱

11、条件Biorad700高效液相色谱系统,配1706uV紫外检测器.检测条件:HypersilC.色谱柱(2504.6mmI.D.,粒径5m),柱温为室温;流动相V(乙腈):V(水)=60:40;流速1.0mlMmin;紫外检测波长254nm;进样量20L;采样时间30min;以峰面积为定量指标.2结果与分析2.1组胺的保留时间和标准色谱图由组胺标准溶液测得组胺的平均保留时问为21.51min,组胺标准品的色谱图如图1所示.g,组胺一.八l5l6I7Il921)2l2223时间/rain图1组胺标准色谱图2.2标准工作曲线和检出限用组胺标准储备液配制一系列标准工作溶液,分别进样分析,以峰面积对浓

12、度做线性回归方程,以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限.结果表明,方法的线性回归方程为Y=8944.035X一39530.785,线性范围为l0200g/mL,相关系数R为0.9999,在所选定的范围内具有较好的线性关系.本方法简单,快速,适合用于食品中组胺含量的测定.2.3样品分析2.3.1大豆发酵制品从表l和表2的测定结果可以看出,散装豆豉(豆豉1)是盒装豆豉(豆豉2)的组胺含量的2倍,豆酱2未检出组胺,而豆酱3中组胺含量则高达1009.37mg/kg,为所测全部大豆发酵制品中含量最高者.豆豉中组胺平均浓度为464.28mg/kg,豆酱固m如m0m粮油食品科技第20卷2012年第2期质量控

13、制为481.50mg/kg,酱油为461.78mg/L,三类大豆发酵制品组胺浓度平均值没有明显区别.在检测的三类共8种大豆发酵制品样本中,七种可检测到组胺,有四种组胺浓度超过500mg/kg,占所有种类的一半,有七种超过100mg/kg,占87.5%.由此可以看出,大豆发酵制品组胺含量水平较高,大量食用可能会影响人体健康.表1豆豉和豆酱中组胺含量的测定结果表2酱油中组胺含量的测定结果2.3.2酸奶样品酸奶样品的测定结果见表3,六种酸奶样品均能检出组胺,其含量在33.36mg/kg至743.77mg/kg之间,平均含量为312.15mg/kg.各品牌酸奶中组胺含量相差较大,有一种组胺浓度超过50

14、0mg/kg,占所有种类的16.7%,有四种超过100mg/kg,占66.7%.其中酸奶1中组胺含量高达743.77mg/kg,可能会对消费者健康产生危害.表3酸奶中组胺含量的测定结果2.3.3啤酒样品表4的结果显示,五个品牌共8种啤酒均能检出组胺,其含量为2.152.66mg/L,各品牌啤酒中组胺含量相差不大,平均值为2.36mg/L.生物胺作为啤酒产品中的成分之一是客观存在和无法避免的,而啤酒中生物胺含量过高可致啤酒风味的改变,影响产品质量,因此生产者应主动在酿造过程中采取适当措施加以限制.表4啤酒中组胺含量的测定结果3结论广州市售的大豆发酵制品(豆豉,豆酱和酱油),酸奶和啤酒中均有组胺检

15、出,其中大豆发酵制品中组胺含量普遍较高.关于食品中组胺的允许水平,我国规定了水产品中组胺的限量标准,鲐够鱼类不得高于1000mg/kg,其他红肉鱼类不得高于300mg/kg,然而上述大豆发酵制品,酸奶和啤酒这些食品中组胺的含量也可能会比较高,我国却尚未作出相关的限量规定,应进一步完善和健全食品安全标准体系.致谢:中山大学公共卫生学院预防医学专业2003级陆丰荣,丁宁,陈华飞,杨志忠,廖明亮,陈宗存和赖辉兵参加了本实验,在此表示感谢.参考文献:1李志军,吴永宁,薛长湖.生物胺与食品安全J.食品与发酵工业,2004,30(10):8490.2何庆华,吴永宁,印遇龙.食品中生物胺研究进展J.中国食品

16、卫生杂志,2007,19(5):451454.3李志军,吴永宁,薛长湖.食品中多种生物胺同时测定方法研究进展J.卫生研究,2006,35(5):670674.4蔡成岗,张慧,王智敏,等.食品中生物胺及其检测方法研究进展J.食品研究与开发,2009,30(1O):153156.5刘辰麒,丁卓平,王锡昌.生物胺的检测方法评价J.现代科学仪器,2006,(4):8991.6刘辰麒,丁卓平,王锡昌.水产品中生物胺的测定方法J.上海水产大学,2007,16(4):357361.7李志军,薛长湖,封锦芳,等.柱前衍生一RPHPLC方法测定水产品中生物胺J3.中国海洋大学,2007,37(3):427431.8王联珠,李晓川,孙建华,等.无公害食品水产品中有毒有害物质限量S.中华人民共和国农,l行,标准NY5073-2006.圆