瓜类细菌性果斑病研究进展.doc
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1、瓜类细菌性果斑病研究进展阎莎莎王铁霖赵廷昌中国农业科学院植物保护研究所北京100193基金项目公益性行业农业科研专项201003066国家西甜瓜产业技术体系CARS36通讯作者Emailtingchangzhaogmailcom收稿日期20110124AdvancesinthebacterialfruitblotchofmelonscausedbyAcidovoraxcitrulliYanShashaWangTielinZhaoTingchangInstituteofPlantProtectionChineseAcademyofAgriculturalSciencesBeijing100193
2、Chi-naAbstractBacterialfruitblotchofmelonsatypicalseedbornediseasecausesseriousdamagesontheplantsofcucurbitsmelonandwatermelonforinstanceworldwideTheagentofbacterialfruitblotchofmelonsisAci-dovoraxcitrulliInthispaperthecurrentsituationofthebacterialfruitblotchofmelonswasreviewedincludingtheadvancesi
3、nthedetectionpathogenicmechanismgeneticdiversityandpreventionofAcidovoraxcitrulliKeywordsAcidovoraxcitrullidetectionpathogenicmechanismgeneticdiversityprevention摘要瓜类细菌性果斑病是发生在甜瓜、西瓜等葫芦科植物上的一种严重的世界性病害此病是典型的种传细菌性病害病原为嗜酸菌属西瓜种Acidovoraxcitrulli。本文围绕瓜类细菌性果斑病菌的分离检测、致病机理、遗传多样性及防治等方面的研究进展作一概述阐明了瓜类细菌性果斑病的研究现状
4、。关键词瓜类细菌性果斑病菌检测致病机理遗传多样性防治中图分类号S4130瓜类细菌性果斑病是葫芦科植物上的一种严重的世界性病害其病原为嗜酸菌属西瓜种Aci-dovoraxcitrulli1。病原菌的命名经历了从类产碱假单胞菌西瓜亚种Pseudomonaspseudoalcaligenessubspcitrulli2到嗜酸菌属燕麦种西瓜亚种Aci-dovoraavenaesubspcitrulli3再到嗜酸菌属西瓜种Acidovoraxcitrulli的过程。瓜类细菌性果斑病菌可以侵染多种葫芦科作物如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等自报道以来已在美国、澳大利亚、巴西、土耳其、日本、泰国、以色列、伊朗、匈牙
5、利、希腊和我国多个省份发生给当地的西甜瓜种植业造成了严重的损失。瓜类细菌性果斑病菌菌体短杆状革兰氏染色阴性不产生荧光严格好氧单根极生鞭毛。能在41下生长不能在4下生长。在KB培养基上呈现乳白色、圆形、光滑、全缘、隆起、不透明菌落菌落直径12mm。该菌引起烟草过敏反应结果不一致不产生精氨酸水解酶明胶液化力弱氧化酶和2酮葡糖酸试验阳性24。果斑病菌在种子中的存活时间长抗逆能力强主要存活于种皮下的胚乳表层5。分别保存了34a和40a的西瓜种子和甜瓜种子种植发芽后用ELISA检测瓜类细菌性果斑病菌结果为阳性可见果斑病菌抗干旱和衰老的能力非常强6。1检测瓜类细菌性果斑病菌是我国进境植物检疫性有害生物因此
6、快速准确地检测果斑病菌是有效防治果斑病的前提。主要检测方法如下11血清学检测方法将血清学技术用于疾病的诊断和控制已有接近百年的历史由于血清学方法灵敏快速、使用方便目前已广泛用于植物病原细菌的检测其缺点是检测精度低、容易出现假阳性。目前报道的用于检测瓜类细菌性果斑病菌的血清学方法主要有酶联免疫吸附测定EnzymeLinkedImmunosorbentAs-sayELISA、直接琼脂双扩散DirectDoubleDiffu-sionDDD、免疫凝聚试纸条检测法、滤膜免疫染色法membranefiltrationimmunostaining等。ELISA法应用最普遍检测果斑病菌灵敏度为105cfu/
7、mL但是容易出现假阳性不能区分与果斑病菌同属的172011年第3期植物检疫PLANTQUARANTINEVol25No3其他3个亚种7。Walcott等采用单克隆抗体免疫磁珠吸附与ELISA相结合的技术检测瓜类细菌性果斑病菌使灵敏度大大提高8。熊亮斌等建立改良DASDotELISA法检测瓜类细菌性果斑病菌以硝酸纤维素膜为载体对DotELISA法的封闭条件、包被抗体浓度、点样量等条件进行优化检测灵敏度为19105cfu/mL。为快速检测西瓜果斑病菌提供了一种新途径9。DDD法为在平板培养基上离菌落一定距离处打适当大小的孔加血清继续培养至沉淀线出现。该方法可以直接在分离平板上鉴定菌落快速、省时检测
8、果斑病菌灵敏度可达107cfu/mL10。利用专化型免疫凝聚试纸条检测果斑病菌时对照线会在35min内出现同时对照线和检测线会由红色变成紫色检测线颜色深浅与被检测的病菌浓度呈正比。免疫凝聚试纸条检测灵敏度为106cfu/mL具有简便、快速、易操作特点适用于田间快速检测和病害诊断11。Matsuura等利用改良的滤膜免疫染色法membranefiltrationimmunostaining检测果斑病菌在1000粒商品种子配成的100mL的PBS缓冲液中可以检测到其中的几粒种子12。该方法可以与选择性培养基筛选相结合为检测果斑病菌提供了新思路。12基于PCR的检测方法PCR方法已成为分子生物学领域
9、的经典试验方法此法灵敏、准确、快速近年来发展迅速并衍生出许多新技术如免疫学和PCR结合、实时荧光定量PCR等。目前基于PCR的检测方法已广泛用于瓜类细菌性果斑病菌的检测。121常规PCR常规PCR的快速检测引物尤其重要。用于果斑病菌检测的PCR引物主要有Walcott等根据16SrDNA序列设计的WFB1/WFB2但是该引物不能将果斑病菌与同属的其他3个亚种区分开7Walcott等根据16S23SrRNA的ITS区InternalTranscribedSpacer序列设计的SEQID4m/SEQID5该引物扩增时嗜酸菌属的其他3个亚种都为阴性13回文广等利用ITS序列设计了特异性引物对果斑病菌
10、进行检测检测灵敏度为3105cfu/mL7Bahar等人报道了一对引物BXL1/BXSR2可检测出5000粒种子中002携带有果斑病菌的种子14田艳丽等根据hrpB2基因序列设计特异性引物HB2F2/HB2R2检测瓜类细菌性果斑病菌灵敏度为103cfu/mL15上述引物序列及反应条件见表1。表1用于检测果斑病菌的PCR引物和反应条件引物名称序列反应条件WFB15GACCAGCCACACTGGGAC3955min9530s65WFB25CTGCCGTACTCCAGCGAT330s7230s30cycles725minSEQID4m5GTCATTACTGAATTTCAACA3955min9530s
11、53SEQID55CCTCCACCAACCAATACGCT330s7230s35cycles725minBXL15CAGCTGGGAGCGATCTTCAT3951min9435s68135sBXSR25GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA37245s35cycles727minHB2F25CCTCCAGCTGCCCGTATC3953min9430s6030sHB2R25CGGACACCCGGTACATCAGC37230s30cycles725min122免疫PCRImmunoPCR免疫PCR技术是1992年由SanoT等最早使用的。该技术将血清学中抗原抗体反应的特异性与PCR的强特异扩增
12、能力结合起来可以在短时间内精确地检测病原物的存在。Song等利用免疫富集PCR法immunoconcentrationPCR和直接PCR法检测果斑病菌对于纯化的菌落悬浮液直接PCR和免疫富集PCR检测灵敏度都能达到3104cfu/mL对于未纯化的种子悬浮液直接PCR的检测灵敏度为3105cfu/mL免疫富集PCR仍然达到3104cfu/mL。可见免疫富集PCR更灵敏、方便已用于进出口种子的检测16。123免疫磁性分离PCRImmunomagneticSepa-rationandPolymeraseChainReactionIMSPCR免疫磁性分离是基于磁性免疫微球immu-nomagnetic
13、microsphereIMMS和PCR的检测方法IMSPCR检测灵敏度高可达到10cfu/mL且可以消除种子碎片等杂质的影响Walcott等研究表明IMSPCR在侵染率为001时仍可以检测到果斑病菌而ELISA和PCR在侵染率小于10时就检测不到果斑病菌了8。124基于实时荧光定量PCRRealtimeQuan-titativePCR的检测方法实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到272011年第3期植物检疫PLANTQUARANTINEVol25No3定量的飞跃优点是自动化程度高、灵敏快速、操作简便、可做多重PCR缺点是仪器昂贵。冯建军等利用TagMan探针实时荧光PCR检测瓜类细菌性果
14、斑病菌灵敏度达103104cfu/mL17。回文广等将生物学、免疫学和分子生物学方法有机结合起来即将选择性培养基富集、IMSPCR、实时荧光定量PCR技术结合起来建立了瓜类果斑病菌快速检测的方法可检测到每千粒种子中的一粒带菌种子7。Ha等将磁珠捕获法和多通道实时荧光PCR法相结合用瓜类果斑病菌和瓜类蔓枯病菌的混合物为模板灵敏度分别为10cfu/mL和105conidia/mL与实时荧光PCR相比灵敏度提高了10倍。可检测到5000粒种子中002的带病种子18。Zhao等用选择性培养基EBB和EBBA对果斑病菌进行培养后分别用直接realtimePCR和realtimeBIOPCR检测果斑病菌可
15、检测到1000粒种子中的1粒病种子。该方法灵敏度高可排除杂菌的影响具有较好的应用前景19。13其他检测方法目前报道的用于果斑病菌检测的其他试验方法主要有环介导基因恒温扩增loopmediatediso-thermalamplificationLAMP和利用特异性单克隆抗体的表面等离子共振成像技术。Oya等利用过滤膜membranefiltration和环介导基因恒温扩增法检测果斑病菌根据hrpG基因到hrpX基因的区间序列设计引物检测灵敏度与实时荧光定量PCR相当20Puttharugsa等将单克隆抗体用于表面等离子共振成像技术surfaceplasmonresonanceima-gingSP
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