教学PPT高通量筛选技术基因工程育种筛选保藏.ppt

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1、,第十三章 高通量筛选技术High throughput screening：指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整个体系运转的技术体系。,第十三章 高通量筛选技术High throughput screening 核心思想：开发合适的筛选模型，转化为光信号或电信号具有自动化操作系统,第一节 常用仪器设备一、微孔板,第一节 常用仪器设备二、微孔板恒温振荡培养器,第一节 常用仪器设备三、多通道移液器,第一节 常用仪器设

2、备四、连续移液器,第一节 常用仪器设备五、多通道连续移液器,第一节 常用仪器设备六、全自动移液工作站,第一节 常用仪器设备六、全自动移液工作站自动菌落挑取仪,第一节 常用仪器设备七、酶标仪,美国 BioTek 酶标仪,第一节 常用仪器设备八、流式细胞仪,第一节 常用仪器设备九、条形码,第一节 常用仪器设备十、数据分析软件（一）sas 国际公认标准（二）spss 非统计学专业人士首选（三）EXCEL,第二节 高通量筛选技术中的常用方法一、微孔板的使用和光学检测法,第二节 高通量筛选技术中的常用方法二、工程菌菌体裂解,第二节 高通量筛选技术中的常用方法三、报告基因绿色荧光蛋白,第二节 高通量筛选技

3、术中的常用方法三、报告基因（一）绿色荧光蛋白,三、报告基因（三）表面展示技术噬菌体展示技术,五、蛋白质芯片,五、蛋白质芯片,第十四章 工业微生物菌种复壮与保藏第一节 菌种退化与复壮菌种退化：是一个群体概念优良菌种，由于传代或保藏，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。,第一节 菌种退化与复壮菌种退化原因：（一）基因突变（二）连续移代（三）培养和保藏条件的影响,第一节 菌种退化与复壮菌种退化原因：（一）基因突变1.有关基因发生负突变导致菌种衰退虽然自发突变的几率很低(一般为10-610-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代

4、次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退的菌株,菌种退化原因2.质粒脱落质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。,菌种退化原因：（二）连续移代连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占

5、据优势越快，致使群体表型出现衰退。,菌种退化原因：（三）培养和保藏条件的影响不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。,菌种退化的防止：1.尽量减少传代2.菌种经常纯化3.创造优良的培养条件4.用单核细胞移植传代5.采用有效的菌种保藏方法,菌种退化的防止：1.尽量减少传代由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的。所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，

6、以降低自发突发的机率。菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。这要求不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的移种传代次数,菌种退化的防止：2.菌种经常纯化,菌种退化的防止：3.创造优良的培养条件在生产实践中，创造和发现一个适合原种生长的条件可以防止菌种退化，如低温、干燥、缺氧等。在栖土曲霉3942 的培养中，有人曾用改变培养温度的措施(从20-30提高到33-34)来防止它产孢子能力的退化。,菌种退化的防止：4.用单核细胞移植传代在有些微生物中，如放线菌和霉菌，由于其菌的细胞常含有几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，

7、用它接种时，就没有这种现象发生。,菌种退化的防止：5.采用有效的菌种保藏方法用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌种保藏方法以防止菌种退化.,三、菌种的复壮及其方法菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不

8、断地从生产中选种,三、菌种复壮的方法1.纯种分离2.淘汰法3.宿主体内复壮法,三、菌种复壮的方法1.纯种分离,三、菌种复壮的方法1.纯种分离-显微操作装置,三、菌种复壮的方法3.宿主体内复壮法如Bacillus thuringiensis主要是对一些寄生性的菌株,可以将衰退的菌株接种到相应的宿主体内,提高其寄生性能及其它性能。,第二节 工业微生物菌种的保藏菌种保藏：广泛收集实验室和生产菌种、菌株，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染便于研究、交换和使用。影响因素：干燥 低温,第二节 工业微生物菌种的保藏（一）斜面保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎

9、好，移至4冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存24个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。,第二节 工业微生物菌种的保藏（一）斜面保藏法,第二节 工业微生物菌种的保藏（一）斜面保藏法实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。,第二节 工业微生物菌种的保藏（二）液体石蜡油保藏法（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，12

10、13灭菌60-80分钟，然后放在80温箱中，使水汽蒸发掉，备用。（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。,第二节 工业微生物菌种的保藏（二）液体石蜡油保藏法优点：制作简单，不需特殊设备，不需经常移种。缺点：是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。,第二节 工业微生物菌种的保藏（三）干燥保藏法1.砂土保藏法将沙或土过筛、烘干、装管、灭菌、然后将

11、菌种制成孢子悬液滴入其中混匀，放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分，干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态，可保存较长时期。此法适用于芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、放线菌、镰刀菌等。,（三）干燥保藏法2.滤纸条保藏法3.无水硅胶保藏法4.麸皮保藏法将麸皮制成培养基,培养要保存的菌种,待生长良好后，置干燥器中保存。这是根据中国酿造酒、醋、酱时制曲的经验所采用的一种保藏方法，适用于谷物微生物区系中的种类。,第二节 工业微生物菌种的保藏（四）冷冻干燥保藏法将细胞悬液每0.10.2毫升注入一无菌安瓿瓶,于-40预冻1小时，再于-2030、真空度为13.3帕的条件下脱水。在脱水过程

12、后期，安瓿瓶外温度可逐渐升至25。脱水后的样品含水量应在 3以下。最后，将安瓿瓶保持真空度 1.3帕，用火焰溶封，置10保存。,（四）冷冻干燥保藏法为防止细胞在冻结和脱水过程中损伤或死亡，要用保护剂制备细胞悬液。保护剂有脱脂牛奶、血清、10蔗糖或葡萄糖溶液等，其作用是通过氧和离子键对水和细胞所产生的亲合力来稳定细胞成分的构型。此法适用于病毒、衣原体、枝原体、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等的长期保存，是当前保藏菌种的一个重要方法。但是，盐杆菌、发光杆菌、粘杆菌、阿舒囊霉、多囊霉、担子菌中的大多数属种不适用于此法保存。,（四）液氮低温保藏法用甘油或二甲亚砜(DMSO)作保护剂制备细胞悬液，分装入

13、无菌安瓿瓶,每管0.2毫升，在控制温度下降速率为1/分钟的条件下预冻至-40，然后立即放入液氮生物贮存罐中气相(-150)保存。恢复培养时，先直接侵入38水浴中解冻 510分钟，再种植于适宜培养基内培养。是在低于-130时一切生化反应处于停止状态、微生物也不能进行代谢活动而设计的冻结法。,（四）液氮低温保藏法为避免冻死、冻伤和细胞内形成大量冰晶，用保护剂制备悬液并控制预冻时的冷却速率和解冻时融化速率。微生物的大多数属种适于慢速冻结和快速解冻。此法适用于病毒、枝原体、各种细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、蓝藻等。,（八）工程菌的保藏（1）灭菌甘油保藏分析纯甘油、-80冰箱保存（2）基因工程菌斜面保

14、藏,二、菌种保藏注意事项,目前，世界上约有 550个菌种保藏机构。美国菌种保藏中心(简称ATCC，马里兰)：1925年建立，是世界上最大的、保存微生物种类和数量最多的机构，保存病毒、衣原体、细菌、放线菌、酵母菌、真菌、藻类、原生动物等约 29000株，都是典型株；荷兰真菌菌种保藏中心（简称CBS，得福特）:1904年建立，保存酵母菌、丝状真菌约 8400种、18000株，大多是模式株；英国全国菌种保藏中心(简称NCTC，伦敦)：保存医用和兽医用病原微生物约2740株；,目前，世界上约有 550个菌种保藏机构。英联邦真菌研究所（简称CMI,萨里郡）：保存真菌模式株、生理生化和有机合成等菌种2763种，8000株；日本大阪发酵研究所（简称IFO，大阪）:保存普通和工业微生物菌种约9000株；美国农业部北方利用研究开发部（北方地区研究室，简称NRRL，伊利诺伊州皮契里亚）：收藏农业、工业、微生物分类学所涉及的菌种,包括细菌5000株,丝状真菌1700株、酵母菌6000株。中国于1979年成立了中国微生物菌种保藏管理委员会（简称CCCCM，北京）。,