基因工程的载体(四)(1).ppt

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1、Types of vectors,Plasmid-based,Virus-based,Chromosome-based,Phage-based,Eukaryotic virus-based(to be reviewed in gene therapy section),YAC,BAC,PAC,Hybrid(phagemid,cosmid etc),The four major types of vectors are plasmids,bacteriophages and other viruses,cosmids(粘粒),and artificial chromosomes.,原核生物的克隆

2、载体真核生物的克隆载体 酵母及其他真菌的克隆载体 高等植物的克隆载体 昆虫的克隆载体 哺乳动物的克隆载体,7 真核生物的克隆载体,酵母和其他真菌的载体高等植物的克隆载体动物的克隆载体,7.1 酵母和其他真菌的克隆载体,7.1.1 2m质粒的筛选标记,2m质粒非常适合于开发成克隆载体。它大小合适，6 Kb；在酵母细胞内具有70200个拷贝。它的复制依靠质粒上的复制起点，复制酶由宿主细胞提供，另外质粒本身还携带两个与复制有关的基因，REP1和REP2。FLP表示重组酶基因。,2质粒的两种构型,A和B是两种构型的2质粒，图谱的环状部分代表单一顺序，直线部分代表反向重复序列（IR），粗线条表示复制原点

3、，REP1、REP2和REP3分别代表复制酶基因和顺式作用位点。2DNA结构上最显著的特点是存在两个反向重复序列(inverted repeat，IR)，它们被一个较大的单一顺序区(约2.7kb)和一个较小的单一顺序区(约2.3kb)隔开。在酵母细胞中，由于这个反向重复序列之间的相互重组，使2质粒群成为两种构型(A和B)的混合物，它们之间的差别仅表现在两个单一顺序区的相对方向不同。,大多数常用的酵母载体，经常使用一个普通酵母基因作为选择标记，比如一个与氨基酸的生物合成有关的酶的基因。LEU2就是一个这样的基因，它编码的-异丙基苹果酸脱氢酶，在催化从丙酮酸到亮氨酸转化过程中起作用。,在用LEU2

4、作筛选标记时，宿主细胞必须是一个营养缺陷型（auxotrophic），含有一个无功能的LEU2基因。LEU2-的酵母，不能自己合成亮氨酸，必须在加入亮氨酸的培养基上才能存活。这样筛选就得以顺利进行了，因为转化体从质粒上获得了一个有功能的LEU2基因，它们的生长不再依赖于亮氨酸的供应。在实际操作中，我们把酵母细胞培养在不添加任何氨基酸的基本成分培养基(minimal medium)上。只有那些成功转化了的细胞才能够存活形成菌落。,Selection is based on nutrition instead of drugs.Yeast cells that are auxotrophic(un

5、able to synthesize an essential component,like an amino acid)can only grow when nutritionally supplemented.,when the missing nutritional function is provided for by genes contained on a plasmid or extra chromosome.,Many eukaryotic vectors contain both eukaryotic and prokaryotic signals and can be re

6、plicated in both types of cells.These are called shuttle vectors.,YEp13,基于2m质粒构建的载体，称为酵母游离型质粒（Yeast episomal plasmids,YEps）。除了包含2m质粒的复制起点和LEU2基因外，YEp13还含有pBR322质粒序列。因此，它可以在酵母和大肠杆菌这两种宿主细胞中进行复制和筛选。,7.1.2 基于2m质粒的载体酵母游离型质粒,在酵母中进行克隆试验的标准步骤：先在大肠杆菌中进行，筛选出重组体，纯化重组的质粒，检查是否符合预期的设想，再把正确的分子转进酵母细胞。,7.1.3 YEp可以插进

7、酵母的染色体DNA,YEp可以和质粒一样进行复制，也可以整合到酵母染色体上。载体携带的筛选标记基因与酵母染色体上的突变基因，有相当高的同源性。例如，在YEp质粒上的LEU2基因和酵母突变了的LEU2基因之间就有可能重组，最终导致整个质粒整合到酵母的染色体上。该质粒可以一直整合到染色体上，也可以再经过一次重组被切割下来。重组后LEU2基因有两个拷贝，通常一个是有功能的，而另一个是沉默的。,7.1.3 其他类型的载体,（1）酵母整合型质粒（yeast integrative plasmids,YIps）是一个把细菌质粒上加一个酵母基因构建的。YIp5就是在pBR322中加入酵母基因URA3。该基因

8、编码的酶催化嘧啶核苷酸合成途径的最后一步。URA3可以像LEU2一样作为筛选标记。YIp不包含2m质粒的任何部分，不能自主复制，但它可以整合到酵母染色体上而保存下来。整合的过程和YEp一样。,Plasmid cannot replicate in yeast since it lacks a yeast origin of replication,酵母复制型质粒携带一段酵母染色体DNA序列，其中包含复制起点(ARS)，所以该质粒可以自主复制。和复制起点接近的地方存在几个酵母基因，以其中的两个座位可以用作筛选标记。它是在pBR322质粒中加上酵母基因TRP1。该基因与色氨酸合成有关，在染色体上紧

9、挨着复制起点。在YRp7中的这一段酵母染色体DNA序列，同时包含TRP1基因和复制起点。,（2）酵母复制型质粒（yeast replicative plasmids,YRps）,Yeast episomal plasmid(YEp)A yeast vector carrying the 2 m circle origin of replication.Yeast integrative plasmid(YIp)A yeast vector that relies on integration into the host chromosome for replication.Yeast repl

10、icative plasmid(YRp)A yeast vector that carries a chromosomal origin of replication.,在某一次特定的克隆实验中，到底选择哪一种酵母克隆载体，要考虑下面3个因素。,转化频率（transformation frequency）,在宿主细胞中的拷贝数,稳定性,用每微克的质粒DNA可以获得的转化体的数目来表示。当需要大量的重组体，或被克隆的DNA的初始量非常少时，高的转化效率非常必要。YEp有最高的转化效率，每微克可以产生10 000100 000个转化的细胞。YRp也不错，每微克可以产生1 00010 000个转化的

11、细胞。但每微克YIp只能产生不到1000 的转化体。,转化频率（transformation frequency）,YEp和YRp有较高的拷贝数：分别是2050和5100。而通常情况下，YIp在每个细胞中只存在一份拷贝。当我们的目的是要获得被克隆的基因所编码的蛋白质时，拷贝数显得很重要，因为基因的拷贝数越多，所获得的蛋白质也就越多。,在宿主细胞中的拷贝数,那是因为YIp可以产生非常稳定的重组体，要丢失整合到染色体上的YIp的可能性非常小。与之对照的是，YRp转化体非常不稳定，在出芽生殖时YIp质粒喜欢聚集在母代细胞中，结果使得子代细胞变回了非转化体。YEp有着类似的毛病，尽管近年来对2m质粒的

12、更深一步了解使得YEp的稳定性有所增加。如果克隆实验要求酵母重组体细胞必须长时间保存克隆的基因，YIp是最佳的选择。,稳定性,7.1.5 可以用酵母人工染色体来克隆大片段DNA,染色体的几个关键成分,（1）着丝粒，在细胞分裂时，需要借助它把染色体正确地分配到子代细胞中去。（2）两个端粒，在染色体的末端的结构，是复制所必需的结束位置，还可以避免染色体被外源外切核酸酶消化。（3）复制起点，与质粒的复制起点功能一样，是染色体上DNA复制的起始位置。,一旦人们认识到了染色体的结构，就在想有没有可能用DNA重组技术把各个组分分离开，再在试管里把它们连接起来，以创造一个新的染色体。因为自然界中存在的酵母染

13、色体的长度有好几十万个碱基对，人们有可能用这种人工染色体来克隆大片段的染色体。,YAC载体的结构和用途,已经开发的YAC(yeast artificial chromosome)载体有好几种，它们都是按照相同的思路构建的，下面用pYAC3来说明。pYAC3以pBR322为基础，插入了一些酵母基因。其中两个基因，URA3和TRP1分别作为YIp和YRp7的筛选标记被介绍过。在YRp7中的那一段酵母染色体DNA除了包含TRP1外还含有复制起点。而在pYAC3中，这段序列扩展得更长，还包含了称为CEN4的一段DNA，即酵母第四号染色体的着丝粒序列。因此，这个插入的片段TRP1-复制起点-CEN4，包

14、含了染色体3个必需成分中的两个。,第三个必需组分是端粒，由称为TEL的两段序列提供。现在还剩下pYAC3的另外一个部分没有介绍，也就是SUP4（赭石突变抑制基因），该基因是筛选标记，也是克隆实验中新的DNA插入位点。,用pYAC3进行克隆的策略如下。把载体用Bam HI和SnaBI双酶切，这样就形成了三个片段。移去Bam HI位点之间的片段，留下另外两个片段，每一片段的末端分别是TEL序列和SnaBI位点。要被克隆的DNA，两端必须切成平端（SnaBI是一个平端内切酶，识别TACGTA序列）。把三者结合起来，就形成了人工染色体。,SnaBI:TACGTA,用原生质体转化的方法把人工染色体转入酿

15、酒酵母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型，trp1-ura-，可以被人工染色体的筛选标记基因恢复成trp1+ura+。在基本培养基平板上培养，可以筛选出转化体。只有那些含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存，如果染色体构建错误，如在被克隆的DNA片段两侧连接了相同的两段载体DNA片段，则因缺少一种筛选标记，使得转化体不能在基本培养基上存活。而外源DNA是否插入，可由SUP4（赭石突变抑制基因）的插入失活判断，即可以简单地由菌落的颜色看出：白色菌落是重组体，而红色菌落则不是。,在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 U

16、AG），或乳白突变（突变为 UGA）。由于发生无义突变的结果，蛋白质合成只能进行到发生这种突变的部位就中止下来。另外一个基因突变（抑制基因突变）结果使细胞内产生某种分子，可使蛋白质合成重新继续下去，因此抑制基因的突变的表型和野生型几乎一样或非常近似。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。,

17、YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3 个方面：首先，在 YAC 载体的插入片段会出现缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。最后，YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。但是 YAC 的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强的容忍性。,7.2 高等植物的克隆载体,7.2.1 根瘤农杆菌自然界最小的遗传工程师,根瘤农杆菌(Agrobact

18、erium tumefaciens)是一种土壤微生物，能够感染双子叶植物使之产生冠瘿瘤（crown gall）。当植物受到外伤时，根瘤农杆菌通过伤口侵染植物，导致冠瘿瘤的发生。,根瘤农杆菌诱导植物体形成冠瘿的能力，与它细胞内存在的Ti（Tumour inducing,即肿瘤诱导）质粒有关。Ti质粒是一个相当大的质粒，长度超过200 Kb，携带大量与感染有关的基因。Ti质粒一个重要的性质在于，感染后，质粒分子的一部分可以整合进植物染色体DNA中。这段称为T-DNA(transfer DNA)的片段（以菌株不同，长度在1530 Kb之间）。T-DNA能在植物细胞内稳定存在，还能作为染色体的一部分传

19、递给子代细胞。,Ti质粒最引人注目的地方还在于T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，并引起植物细胞癌变。这些基因包括指导生长素（auxins）和细胞分裂素（cytokinins）合成的基因，以及指导合成冠瘿碱合成（opines）的基因。生长素和细胞分裂能促进细胞增殖（cell proliferation)。冠瘿碱是农杆菌的营养物质，为根瘤农杆菌的生长提供碳源和氮源。根瘤农杆菌对植物进行了基因改造来为它自己服务。,The transfer DNA(abbreviated T-DNA)is the transferred DNA of the tumor-inducing(Ti)plasm

20、id of some species of bacteria such as Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes.It derives its name from the fact that the bacterium transfers this DNA fragment into the host plants nuclear DNA genome.The bacterial T-DNA is about 20,000 base pairs long and contains genes that code for

21、enzymes synthesizing opines and phytohormones.By transferring the T-DNA into the plant genome,the bacterium essentially reprograms the plant cells to grow into a tumor and produce a unique food source for the bacteria.The synthesis of the plant hormones auxin and cytokinin enables the plant cell to

22、grow uncontrollably,thus forming the typically induced by Agrobacterium infection.The opines are amino acid derivatives used by the bacterium as a source of carbon and energy.,Opine catabolism,Virulence region,ORI,T-DNA,The T-DNA is bordered by 25-base-pair repeats on each end.Transfer is initiated

23、at the left border and terminated at the right border and requires the vir genes of the Ti plasmid.,于是，人们很快意识到可以用Ti质粒把新的基因转运到植物细胞。所要做的仅仅是新基因插入T-DNA，而对于如何把它们整合到植物染色体上去，这些复杂的工作，就交给农杆菌去完成。但在实际操作时却发现这是相当棘手的一件事情：Ti质粒太大了，造成操作比较困难。最主要的问题是，要想在一个200 Kb的质粒中找到一个单酶切位点，简直是不可能的事。必须制定如何把外源DNA插入到质粒中去的新策略。,对Ti质粒进行改造

24、,必须把Ti质粒加以改造，才能成为植物基因工程载体。首先要除掉野生型Ti质粒上使细胞发生癌变的基因，这样转化后的细胞才不至于癌变，才能发育成植株。这是可以办到的，因为与细胞癌变有关的基因仅仅存在于T-DNA的内部，且与感染不相关。感染主要由Ti质粒的病毒性区域控制。,事实上，T-DNA内与感染有关的部分只是两段长25 bp的重复序列，它们处于整合区域的两端。任何在两端拥有这两个重复序列的DNA，都会被认为是T-DNA，会被整合到植物染色体上。因此，我们可以从正常的T-DNA中去除癌基因，然后加上一套新的基因，而不用担心会影响感染过程。,（1）双元载体系统（Binary vector）,双元载体

25、系统由农杆菌中两个自我复制的质粒构成。一种是微型质粒（mini-Ti plasmid），这是一种穿梭载体，可以在大肠杆菌和农杆菌中进行复制，含有左右T-DNA边界，在两个T-DNA边界之间插入目的基因。另一种是辅助Ti质粒，为T-DNA向植物细胞的转移提供vir基因功能。,用Ti质粒向植物细胞内引入新的基因,一个典型的微型质粒包括如下组分：（1）多克隆位点；（2）一个广泛寄主范围复制起点，该复制起点在大肠杆菌和农杆菌中都能发挥作用；（3）在细菌细胞中起作用的选择标记；（4）在植物细胞中的选择标记；（5）T-DNA的左右边界。辅助Ti质粒含有指导T-DNA转移的vir基因，但是T-DNA被完全删

26、除。,vir genes and T-DNA can be on separate plasmids,only left and right borders(LB&RB)are required for T-DNA to be transferred,改造pBR322或是其他类似的大肠杆菌质粒，让它们携带T-DNA的一小部分。这个新构建的质粒和Ti质粒的同源序列意味着，当它们共存于同一个根瘤农杆菌内时，两者之间会发生重组，使得pBR质粒整合进T-DNA区域。这样，我们就可以把要克隆的DNA插入到pBR质粒的单酶切位点上，转化进含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经重组新基因被整合进T-DNA。感染植物后

27、，新基因就和T-DNA一起被整合到植物染色体上。,（2）共整合策略（cointegration strategy）,获得Ti质粒转化的植株,用根瘤农杆菌去感染培养在液体培养基中的植物细胞或是原生质体，然后，在选择培养基平板上筛选出转化体。由转化后的细胞发育再生得到成熟的植株，它的每一个细胞都含有被克隆的基因，并把这些基因传递给它的后代。然而，必须把Ti质粒加以改造（disarmed），这样转化后的细胞才不癌变，发育成植株。这是可以办到的，因为使细胞癌变的基因仅仅存在于T-DNA的内部，且与感染不相关，感染主要由,Ti质粒的病毒性区域所控制。事实上，T-DNA内与感染有关的部分只是两段长25 b

28、p的重复序列，它们处于整合区域的两端。任何在两端拥有这两个重复序列的DNA，都会被认为是T-DNA，会被整合到植物染色体上。因此，我们可以从正常的T-DNA中去除癌基因，然后加上一套新的基因，而不用担心会影响感染过程。,现在，可供选择的无致癌性的Ti质粒有很多，一个典型的例子是双载体系统pBIN19。在T-DNA的两个重复序列之间，连有两个筛选标记基因，一个含有多克隆位点的lacZ基因，另一个是卡那霉素抗性基因，后者在整合进植物染色体后起作用。正如，酵母的穿梭载体一样，最初的操作在大肠杆菌内进行，把要克隆的基因插入pBIN19，筛选出重组体，再转化根瘤农杆菌，最后进入植物细胞。成功转化的植物细

29、胞可在含有卡那霉素的平板上筛选出来。,7.2.2 DNA直接导入的基因转化法,要想把外源基因成功地转化到植物细胞中去，必须考虑到3个方面：如何使外源基因能进入植物细胞？进入植物细胞的基因是整合到基因组中，还是滞留在细胞质中？用于转化的外植体是否能再生，形成完整的植株？植物基因转化系统大致有两种途径：一种是DNA直接转化，即不经过任何载体把裸露的DNA通过各种物理或化学方法直接导入植物细胞；另一种是经载体介导的转化系统，例如经农杆菌Ti质粒和植物病毒载体介导的基因转化途径。,直接转化法基于1984年首先观察到的一个现象，一个超螺旋的细菌质粒，虽然不能在植物细胞内自我复制，但可以通过重组而整合到植

30、物细胞的某条染色体上。虽然，对重组的机制还不甚了解，但几乎可以肯定与T-DNA的整合截然不同。它也不同于酵母载体与酵母染色体的重组整合，因为它不需要细菌质粒与植物DNA有同源序列。事实上，这种整合似乎随机发生在任何一条植物染色体的任何一个位置上。,直接转化法,基因枪法,基因枪法的基本原理是将包裹有DNA的金属小颗粒（通常为钨粒、金粒），以某种爆发的方式加速到一个很高的速度，从而轰击植物受体细胞或组织，穿过细胞壁进入细胞，附载在金属颗粒上的DNA整合到植物基因组中。由于基因枪法能转化任何植物，特别是对农杆菌不敏感的单子叶植物，又省略了其他直接转化途径需要制备原生质体的繁琐步骤，故受到研究人员的青

31、睐。,7.2.3 用植物病毒作克隆载体,改造后的和M13噬菌体是针对大肠杆菌的非常重要的克隆载体。大多数植物细胞都易遭受病毒的感染，那么病毒是不是可以用作植物的克隆载体呢？如果真的可行，使用这种载体要比其他载体方便得多，因为许多病毒仅仅只需要和植物的叶片接触，就能感染植物，完成转化，而且还可以通过自然的过程使整个植株都被感染。,植物病毒的侵染机制：侵染过程通常是病毒先黏附于细胞膜上，两者的膜相合并，病毒的遗传物质由合并处进入细胞质，或者由于膜的卷曲，病毒进入细胞质内，然后脱去套膜和壳膜，放出遗传物质（DNA或RNA）。,接着在分子水平上进行如下过程：（1）DNA进入细胞核，在核内DNA复制酶系

32、统的调控下进行DNA复制；（2）mRNA将病毒信息传递到细胞质；（3）mRNA利用寄主细胞的蛋白质合成系统合成病毒蛋白；（4）病毒蛋白合成后，一部分留在细胞质内，结合到质膜上，另一部分进入到细胞核内，组成病毒衣壳；（5）病毒颗粒进入细胞质，在质膜上发育；（6）在质膜上发育成熟 的病毒颗粒排到细胞外，再感染新的宿主，一般把这种具有复制功能的病毒称为成熟病毒颗粒。,人们对植物病毒载体探索了很多年，但没有重大突破。一个难题是大多数植物病毒的基因组都是RNA而非DNA。因为对RNA的操作很难进行，RNA病毒不适宜开发作为克隆载体。仅有两类DNA病毒可以感染高等植物，花椰菜花叶病毒（cauliflowe

33、r mosaic virus,CaMV）和geminivirus，但它们用作克隆载体都不是很理想。,根据对CaMV的基因组结构、CaMV复制、表达及其基因删除和外源基因插入的研究结果，人们对CaMV作为植物基因工程载体进行了应用性探索，在1984年，最早获得成功的植物基因工程实验，就是在萝卜中通过caulimovirus载体转入了一个新的基因，但对于这类病毒载体而言有两个缺点限制了它们的应用。,首先，就像噬菌体一样，能够包装进蛋白质外壳的DNA的长度仍是非常有限的。最近的研究表明，通过引入辅助病毒，人们有望突破这个限制。例如，用作克隆载体的花椰菜花叶病毒（cauliflower mosaic

34、rirus,CaMV）去掉了一些必要的基因，这意味着它可以插入更长的DNA片段，单靠他自己不能直接感染植物。当感染植物时，载体DNA需要一个正常的花椰菜花叶病毒基因组的辅助。这个正常的病毒基因组，为克隆载体提供了包装进病毒外壳的基因，并使它感染整个植株。,尽管这是一个很有潜力的进展，但它还是不能解决所面临的第二个难题：CaMV的宿主范围太窄了。这把克隆实验限制在少量几种植物中，主要是芸苔类植物，如萝卜、胡萝卜和花椰菜。,然而，caulimovirus 的能在所有植物起作用的高效启动子（35S启动子），使得它在基因工程中非常有用，可用来表达有Ti质粒或直接转化法即如植物细胞内的基因。总之，CaM

35、V DNA基因组的特点及其在植物细胞中由RNA聚合酶II催化转录等一系列性质，及其DNA可删除和插入的耐受性表明，CaMV是一种潜在的基因载体，但是从CaMV的寄主范围，基因组复制和表达的特征及插入外来基因组大小的限制来看，要把它作为改良农作物的基因载体系统还有一段距离。,Geminivirus（双生病毒）载体，天然寄主包括玉米和小麦，可以应用于这两种植物以及其他单子叶植物。难题：在感染周期中，一些病毒会发生基因重排和删除，这会搅乱插入的DNA。,Geminivirus vector,7.3 动物的克隆载体,迄今为止，人们已经投入了大量精力研发用于动物细胞的克隆载体。人们需要这些载体来表达那些

36、不能在大肠杆菌和酵母中正常表达的重组蛋白，另外还需要这些载体克隆人类的基因，以探索基因治疗技术。基于临床上的考虑，人们把大部分的注意力放在哺乳动物的克隆体系上，但是在昆虫表达体系上也获得了重要的进展。,7.3.1 昆虫的克隆载体,用P元件作果蝇的克隆载体,果蝇克隆载体的开发走了一条与细菌、酵母、植物和哺乳动物完全不同的技术路线。在果蝇细胞中没有发现任何质粒，虽然，果蝇也受病毒的侵染，但人们并没有基于这些病毒开发载体。实际上，人们使用称为P元件(P element)的一种转座子进行果蝇的克隆载体。,转座子在各种生物中普遍存在。它们是一短的DNA序列，长度通常不超过10 Kb，在细胞中能从染色体的

37、一个位置转移到另一个位置上。P元件就是存在于果蝇中的转座子之一，它有2.9 Kb长，在P元件的两端含有一小段反向重复序列,中央区编码转座酶。这段反向重复序列对于P元件的转移是必不可少的。转座酶能识别转座子两端的方向重复序列，并执行转座功能。,P元件不仅能从基因组的一个位置移动到另一个位置，还能从含有P因子的质粒移动到果蝇的染色体上。而后一种情况正是应用P元件作克隆载体的关键。克隆载体被设计成含有两个P元件，其中一个P元件中有可插入外源片段的酶切位点。当插入外源基因后，转座酶的编码序列被破坏了，因此这个P元件是无活性的。相应地，该质粒中的另一个P元件所携带的转座酶基因是完整的。但是，它两端的反向

38、重复序列被删除了，,当质粒DNA被显微注射到果蝇的胚胎中去，后一个P元件上的转座酶基因编码的转座酶，转座酶把带有外源基因的P元件转到染色体上。若这一过程发生在生殖种系细胞的细胞核中，那么由这个胚胎发育来的成年果蝇在它的所有细胞中均含有这个新的基因。P元件克隆技术在20世纪80年代被开发出来，并对果蝇的遗传学研究做出了许多重大贡献。,Generation of transgenic fruit flies by P-element transformation.The P element,a mobile genetic element,can move from one place in th

39、e genome to another.This movement(transposition)is catalyzed by transposase,which is encoded by the P element;the 3 and 5 ends of the P element are recognized by transposase and are required for transposition to occur.To produce transgenic fruit flies by this method,the functionally different region

40、s of the P element are incorporated into two different bacterial plasmids.,The donor plasmid contains three necessary elements:the transgene(orange);a marker gene(green)used to indicate flies in which the plasmid DNA is transposed to a recipient chromosome;and both ends of the P element(dark purple)

41、3 P and 5 P flanking the other two genes.It does not contain transposase.In this example,the marker is the dominant w+allele,which confers red eye color.The red bracket indicates the segment of the donor plasmid that can transpose into the fly genome.The other plasmid carries the P element(encoding

42、transposase)with mutations in one end,which prevent it from transposing.,The two plasmids are co-injected into blastoderm embryos homozygous for the recessive w allele,which confers white eye color.Transposase synthesized from the gene on the P-element plasmid catalyzes transposition of the donor pl

43、asmid DNA into the fly genome.Because transposition occurs only in germ-line cells(not in somatic cells),all the G0 adults that develop from injected embryos have white eyes.Mating of these flies with white-eyed flies will yield some G1 red-eyed progeny carrying the transgene and the marker allele(w

44、+)in all cells.,P elements in nature are normally active only in the germline because the third intron of the P transposase mRNA is spliced out in that tissue,but not in the soma,基于昆虫病毒的克隆载体,尽管人们并没有开发应用于果蝇的病毒载体，但有一类病毒在以其他昆虫为宿主的基因克隆中发挥着重要作用，那就是杆状病毒（baculovirus）。杆状病毒的主要用途是产生重组蛋白质。,杆状病毒基因组是单一闭合环状双链DNA分

45、子，大小为90160kb。杆状病毒研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosisvirus,AcMNPV)，其宿主是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,Sf)；家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)，其宿主是家蚕(Bombyx mori)，用来表达外源蛋白也多用这两种杆状病毒载体,杆状病毒的基因表达分为立早期表达、早期表达、晚期表达、极晚期表达4 个阶段。其中在极晚期基因表达过程中有两种高效表达的蛋白：多角体

46、蛋白和P10 蛋白，两个基因的启动子均具有很强的启动性。多角体蛋白基因polh是一个表达量极高的极晚期基因，感染后期在细胞中的累积可高达30%50%，从基因组中删除polh基因时，其子代病毒不能形成多角体，但并不影响病毒体的复制，因此，polh基因位点是杆状病毒表达系统的理想外源基因插入位点。P10也是一个高效表达的极晚期基因，同时又是病毒复制非必需基因，因此P10位点也常被用作外源基因插入位点。,安全性高：杆状病毒的宿主仅限于无脊椎动物，而对人畜和其他脊椎动物没有感染性，特异性强。表达效率高：应用杆状病毒极晚期多角体蛋白启动子和P10蛋白启动子强效表达外源蛋白，表达量最高可达所感染细胞总蛋白

47、量的50%。表达的蛋白具有生物学活性：昆虫细胞为真核生物细胞，其对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近，能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，并且使外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成，使其在结构及功能上接近天然蛋白。,杆状病毒表达载体系统的优越性,(4)外源基因在插入到多角体蛋白基因座位时，必然引起后者的缺失或灭活，因此，重组病毒将不能产生多角体，这不仅为重组病毒提供了供选标记，而且重组病毒不能像野生病毒一样在环境中存在，更加安全。(5)容量大：杆状病毒基因组大约130Kb，具有多个天然强启动子，也易于构建新的人工启动子，可同时表达多个基因，并且可

48、容纳大片段外源基因。(6)基于BmNPV所构建的重组病毒具有更狭窄的宿主范围，除了家蚕外，基本没有其他宿主，而且家蚕没有飞行能力，完全靠人类饲养，而且关于家蚕的研究已持续多年，遗传背景相对清楚，大规模饲养技术成熟，成本大大降低。,杆状病毒表达载体系统的优越性,杆状病毒由于基因组相对较大,外源基因的克隆不能通过酶切连接的方式直接插入，必须通过转移载体的介导。构建转移载体时，将拟插入杆状病毒位点的基因(如多角体基因和P10基因)编码区的侧翼序列分别克隆进入同一质粒载体中，然后将外源基因及相应的启动子克隆在两段侧翼序列之间。转移载体构建成功后，将载体与野生型杆状病毒共转染昆虫细胞，通过两侧同源边界区

49、在细胞内发生同源重组，外源基因及启动子替代杆状病毒相应的区域而产生重组病毒。,杆状病毒表达载体系统的构建策略,7.3.2 哺乳动物的克隆载体,当前，把外源基因导入哺乳动物无外乎3个目的：（1）为了做基因敲除，基因敲除是一项用来鉴定一个未知基因功能的重要技术。（2）为了用哺乳动物细胞产生重组蛋白，相关的技术即生物制药是对某种动物进行基因改造，饲养它以获得某种珍贵的蛋白质，比如某种药物，而这些重组蛋白通常随动物的乳汁分泌出来。（3）基因治疗，对人类细胞进行基因改造以治疗某种疾病。,哺乳动物的克隆载体,将基因转入哺乳动物细胞所用的载体也是以病毒为基础构建的。第一个被利用的是SV40，该病毒可以感染多

50、种哺乳动物细胞。SV40的基因组大小是5.2 Kb，包含两套基因：早期基因在感染的早期表达，产生与病毒复制有关的蛋白质；晚期基因，编码外壳蛋白质。,SV40,和噬菌体一样，当用SV40作载体时会遇到相同的问题：病毒外壳对DNA长度的要求限制了插入的外源DNA分子的大小。因此，当用SV40作载体时必须换掉病毒基因组中的一两个基因。在早期的实验中通常晚期基因是替换的对象，而替换掉早期基因也是一个选择。,牛乳头状瘤病毒（BPV）,许多哺乳动物的病毒在感染后迅速杀死宿主细胞，那么，除非是短期的转化实验,我们需要一些技巧来避免这种情况发生。牛乳头状瘤病毒（BPV），能导致牛长出疣，有作为克隆载体的潜质，