磷脂酶D的细胞信号转导作用cropped.doc

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1、把 磷 脂 酶 分 为 5 类(图 1)，即磷脂酶 A1(PLA1)、磷磷脂酶D的细胞信号转导作用钟秀丽1，崔德才2*，李玉中1( 1 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 10 00 81 ；2 山东农业大学生命科学学院，泰安 27 10 18 )摘要：磷脂酶 D (PLD)是一类重要的跨膜信号转导酶类。分别由一个基因家族的不同成员编码。植物PLD的 总体域结构相似，只是不同类型之间在某些单元上有重 要差异。它们各具独特的生物化学特性。不同的PLD在 不同的胁迫类型启动的特定的细胞过程中执行独特的细 胞信号转导功能。PLD 与其它磷脂酶及 Ca2+ 信使之间 有交互作用，形成复杂的

2、信号转导网络。这一网络在不 同植物种类、器官、组织和细胞类型中表现出特异性。 文章最后讨论了PLD 研究中有待揭示的问题并展望了 今后的发展方向。揭示出PLD 信号转导途径与PLC 和PLA2 信号转导途径同样重要。本文对这些最新进展进行综述。同时着重分析不同的细胞过程中 PLD 的功能以及PLD 与其它信使物质之间的关系，了解包含 PLD的信号转导网络的特异性。关注这一问题将有助 于揭示对各种刺激均做出反应的共同信号物质如何 精确转导复杂胞外信号的机制。关键词：细胞信号；磷脂信号；磷脂酶 D ；特异性中图分类号：Q7 1磷脂不仅仅是生物膜的骨架成分，而且能通过水解后产生的产物来参与多种生理过

3、程以及环境 刺激引起的细胞反应。磷脂酶是催化磷脂水解的 第一步的关键酶，根据水解磷脂的部位不同可以脂酶 A2(PLA2)、磷脂酶 B(PLB)、磷脂酶 C(PLC)和磷脂酶 D(PLD)。关于 PLA1 和 PLB 的研究报告至今仍很少，PLA2 和 PLC 的细胞信号转导功能发现较早，研究信息已经积累了很多，主要集中在动物方面。PLD 于上世纪 40 年代就在植物中被发 现(Hanahan 和 Chaicoff 1948)，但是半个多世纪以 来，人们只关注它在植物衰老和机械损伤时催化 膜脂降解的这一功能。直到近年才发现，各种环 境刺激，包括低温、水分胁迫、病原菌激发和 激素刺激均会迅速激活P

4、LD (Ryu和Wang 1996; Fan 等 1997; Lee 等 1997)。在 ABA 的信号转导中，抑 制PLD 活性会导致信号传递全部或部分受阻(受阻 程度因细胞类型而异) (J acob 等 1 99 9; Ritchie 和 Gilroy 1998)。基于这些发现，PLD 才被确认为重 要的跨膜信号转导酶。由于 PLD 的细胞信号转导 作用的发现，这个“古老”的酶又引起新的关 注。近几年来，关于 PL D 的结构、生物化学特 性与细胞信号转导功能方面的研究报告迅速增加，图 1 不同磷脂酶水解结构磷脂的部位Fig.1 Sites of hydrolytic cleavage o

5、f phospholipids by PLA1, PLA2, PLB, PLC, PLDModification from Wang (2002).1PLD 的结构与生物化学特性1.1PLD 的域结构特征迄今为止，已经从蓖麻、拟南芥、豇豆、 甘蓝、烟草、水稻和玉米等多种植物中克隆到PLD 基因，仅拟南芥中就已经确认了 12 个基因。根据这些基因的结构和它们编码的 PLD 的序列相2004- 11- 22 收到，2005- 07- 11 接受。国家自然科学基金项目( N o . 304701 65) 资助。* 通讯作者( E-ma i l: cd ca i s d au .e du. cn; T

6、 e l: 05 38 -8 2 4 2 6 5 6 -8308) 。 综 述 Review 似性、域结构、生化特性以及 cD N A 克隆的顺序，把这些基因分成 5 类，即 PL D 、PL D 、 PLD 、PLD 和 PLD 。在动物细胞中克隆到两 个 PLD 基因，PLD1 和 PLD2。在酵母中报告了两 个 PL D 基因，但只有一个得到鉴定。植物 PLD 的总体域结构是相似的，但是有些 单元有重要差异。除了 PLD 外的植物 PLD 都包含有 C2 域，这是植物 PLD 所特有的结构，在动物和酵母中都没有发现。C2 域是一个 Ca2+ 与磷脂 结合的折叠域，该结构域中二分环(bip

7、artite loop) 上的 4 5 个氨基酸的性质与 Ca 2+ 的结合有关 (Ponting 和 Parker 1996)。PLD 和 PLD 二分环上 保留了所有的酸性氨基酸(Qin 等 1997)，而 PLD的二分环上则有两个被碱性或中性氨基酸残基取代，因而减弱了 PLD 对Ca2+ 的亲和性。多数PLD 都有两个 PIP2 结合位点，一个是近 N- 末端的 C2 域，一个是近 C- 末端的催化域附近的多磷脂酰肌醇 (PPI)结合单元。不同 PLD 之间的这个 PPI 结合单元 也有差异。PLD 上包含结合单元RxxxxKxRR (即 精氨酸 xxxx 赖氨酸 x 精氨酸精氨酸)和一

8、个反转序 列单元RKxRxxxxR(Qin 等 1997)。在 PLD 中这4 个保守的氨基酸残基中保存 3 个，而 PLD 中保 守性最低(有的被酸性残基取代)。PLD 中有一个 十四酰基化(myristoylation)保守序列。这是 PLD 和 PLD 所不具备的(Qin 等 1997)。在拟南芥中， Ca2+ 结合到 PLD1 和 PLD1 的 C2 域，引起酶的 构象变化，从而增强 C2 域对磷脂酰胆碱(PC)的亲 和力(Zheng 等 2000)。PLD1 被磷脂酰肌醇 4, 5-物 PLD 更为接近。PLD 特殊的域结构说明它的激活特性可能不同于其它 PLD 。1.2PLD 的生

9、物化学特性PLD 结构的多样性正是它们各自拥有独特的 生物化学特性的基础。植物 PLD 的 C2 域的存在说 明了 PLD 以一种特定的方式被 Ca2+ 激活。由于 C2域和 PIP2 结合单元在不同 PLD 之间有重要差异，这些 PLD 的激活对 Ca2+ 和 PIP 的需求不同。PLD2在以单独一种磷脂作为底物的离体实验中需要毫摩尔水平的 Ca2+ 激活(Qin 等 1997)。最近的研究中发现，在酸性(pH4.55.0)下，PIP 存在时，在 Ca2+2浓度接近其生理浓度时检测到了 PL D 活性(Pappan 和 Wang 1999)。PLD 和 PLD 则需要 Ca2+2+和 PIP

10、2 协同激活，在微摩尔的 Ca 水平下最活跃(Qin 等 1997)。PLD 不含有 C2 域，但是含有 PX和 PH 域，它的激活不需要 Ca 。而像 PLD 和PLD 一样需要 PIP2(Qin 和 Wang 2002)。PLD 的 特征是其激活依赖于油酸，其它不饱和脂肪酸即 亚油酸和亚麻酸的激活程度差一些，而饱和脂肪酸如硬脂酸和棕榈酸则没有激活作用(Katagiri 等2001)。另一方面，实验中还发现溶血磷脂酰乙醇 胺(LysoPE)(Ryu 等 1997)和 N- 酰基乙醇胺(NAE)(Austin-Brown 和 Chapman 2002)是 PLD 的负调节 因子。2+值得注意的

11、是，这些 PLD 的调节因子(Ca2+、PIP 、游离脂肪酸、溶血磷脂等) 大多还是 PL A22和 PLC 的底物、产物或下游靶物。PLC 的功能之一是产生三磷酸肌醇(IP3 )，它能引起细胞质中的2+2+2 磷酸(PIP2)和 Ca 协同激活，PIP2 分别在 C2 域和催化区与 PLD1 结合，但是这种结合受到 Ca2+ 浓Ca 水平的增加(Staxen 等 1999)。PIP2 是一种含量很低的植物脂类，是 PLC 的底物。游离脂肪酸和度的调节。在无 Ca2+ 或 Ca2+ 浓度较低时，PIP 结溶血磷脂则是 PLA 的产物。PLD 的负调节因子2合在 PLD 1 的 C2 域。相反当

12、 Ca 2+ 浓度较高时，在 C2 域的结合受到抑制，促使 PIP2 结合在 PLD1 的催化区，这种结合进一步促进 PLD1 与 PC 结 合(Zheng 等 2000, 2002)。还有一类特殊的 PLD，被命名 PLD。它们 的特征是有 PX(phox homology)域和 PH(pleckstrinhomology)域，但是没有 C2 域。PH 域由约 120 个氨基酸构成，能够与多种磷脂酰肌醇结合，但是 可能具专一性(Lemmon 和 Ferguson 2000)。动物 PLD 也包含PX和PH域，但是不包含C2域(Frohman 等 1999)。所以，PLD 的域结构和序列特性与

13、动2NAE 则是PLD 或PLD水解N- 酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)的产物。另一方面，PLC 的底物 PIP2 的合 成也受 PLD 的影响，在动物体系中发现，PLD 催 化反应的产物磷脂酸(phosphatidic acid, PA)能够激 活 PI-5 激酶(Jenkins 等 1994)，它是 PIP2 合成的关 键酶。因此有学者提出动物细胞 PLD 和 PIP-5 激 酶的激活形成一个正反馈作用环，使 PA 和 PIP2 迅速产生，这种作用进而增强 PLC 的活性与功能。在植物中，PA 能够与植物PI-4 激酶结合(Stevenson等 1998)，但是 PLD 在植物的多磷酸肌醇形

14、成中的 作用目前还不清楚。另外，PLD 的产物 PA 能够激活 PLA2。可见，PLD 与其它磷脂酶之间以及不同的 PL D 类型之间可能有复杂的激活与抑制关系。 除了受上述调节因子的影响，PLD 还受到 pH 的影响。PLD 和 PLD 只在中性 pH 下活性最强， 在酸性 pH 下没有活性。在接近生理 Ca2+ 浓度的情 况下，PL D 在酸性 pH 下有活性(Qi n 和 Wan g2002)。说明细胞内 pH 的变化对不同的 PLD 类型的影响不同。另外，Ritchie 和 Gilroy (2000)还发 现，PLD 受三聚 G 蛋白的调节。植物中这种调节 机制还不清楚。在动物中小 G

15、 蛋白如 ADP 核糖基 化因子(ARF)和Rho对PLD 的调节机制则已经清楚 了。不同 PLD 的调节机制各有不同之处，说明它们可能各自执行不同的信号转导功能。不同的 PLD 的底物专一性不同。PLD 以一 种以上的磷脂作底物，通常的结构磷脂如磷脂酰 胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰甘油(PG) 都是很好的底物，但是它几乎不能水解磷脂酰肌 醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、N- 酰基磷脂酰乙醇 胺(N AP E ) 、心磷脂和缩醛磷脂( Ab ousa l ha m 等19 97 ) 。PL D 和 PL D 不但能够水解 PC 、PE 、PG，还能够水解 PS 和 NAPE。P

16、LD 和 PLD 水 解同样的底物，但是 PLD 优先选择 PE 和 NAPE， 而 PLD 则不然。不依赖于 Ca2+ 的 PLD 表现出独 特的底物专一性，它水解的是 P I ( W issi n g 等199 6) ，而 PL D 、PL D 、PL D 都不水解 PI 。所以，激活不同的PLD 可以导致不同种类和数量的 磷脂被水解，因而产生的 PA 的分子种(molecular speci es)的组成会有差异。图 2 PA 与其它磷脂信号物质之间的相互转化Fig.2 Interconversions of PA and other lipid signal messengers LP

17、 PS: Lipid phosph ate phosphatases; DAGK: DAG kin ase; PA K : PA k i na s e ; PC: Pho s p h a t i d y l c h o l i n e ; PE: Ph osphatidylethan olamin e; PG: phosph atidylglycerol; PLA: Phospholipase A; PLC: Phospholipase C; PLD: PhospholipaseD; PIP 2 : P hosphatidylinosito l 4, 5 -bisph osph at e; D

18、 AG : Diacylglycerol; PA: Phosphatidic acid; DGPP: Diacylglycerol pyrophosphate; FFA: Free fatty acid; PL: Phospholipid; LysoPL:Lysophospholipid; LysoPA: Lysophosphatidic acid.1998)，DGPP 也可以在磷脂磷酸酶的作用下脱磷酸化形成 PA (Munnik 等 2000)。 值得注意的是，PA 及其进一步代谢产生的DAG、LysoPL 和 FFA 等信使物质除了 PLD 途径 以外，还可以由其它磷脂酶途径产生，进一步说

19、 明磷脂酶之间存在复杂的相互作用。如PA 和DAG 两种可以相互转化的信使物质，都具有 PL D 和 PLC 两条产生途径。从目前的研究结果看，动物中可能使用 PA 和 DAG 两种信使物质。已经发现PA 能够激活多种信号蛋白，DAG 能够激活PKC超 级家族成员。然而，植物缺少 PK C ，DAG 可能 在 DAG 激酶的作用下迅速转化成 PA，作为信使 物质将信号向下游转导，所以植物可能主要以 PA 作为信使物质(Laxalt 和 Munnik 2002)。PA 在 PA 激酶的作用下产生的 DGPP，是新发现的一种磷脂。Munnik 等(1996)用 G 蛋白活化 剂黄蜂毒素(masto

20、paran)处理衣藻，激活 PLD 和 PLC 信号转导途径后首次检测到DGPP 的存在。后 来又发现植物细胞受到干旱、盐和渗透胁迫、病 原菌激发等各种刺激后DGPP水平均发生迅速而短2PLD 作用的直接产物 PA 及其下游事件2.1PA 的代谢与转化不同 PLD 特异性地水解各种磷脂，直接产生 PA。PA 本身就是信使物质，能够激活靶物使它 将信号向下游传导。同时 PA 还可以进一步代谢生 成其它信使物质(图 2)。如在磷脂磷酸酶的作用下 脱磷酸化形成二酯酰甘油(DAG)，还可以在 PA 激酶的作用下磷酸化形成焦磷酸DAG(DGPP)(Munnik 等2000)，也可以在PLAs 的作用下去

21、酰基形成FFA 和溶血磷脂酸(Lys oPA) (M ei jer 等 20 01 )。同样， DAG 也可以在 DAG 激酶的作用下磷酸化形成 PA (van der Luit 等 2000; den Hartog 等 2001; Munnik 等暂的变化，在未受刺激的细胞中则很难检测到，而且 DGPP 的浓度很低，这些都是信号分子的特征。然而，每一种信使物质在受到生理刺激水平升高之后都需要迅速降低它的生理活性水平，以 便细胞对下一个刺激做出反应，同时也避免信使 物质浓度过高影响正常的生理代谢。Mu nn ik 等 (1996)认为PA磷酸化生成DGPP的途径是植物细胞 发育出的独特的降低

22、PA 水平的机制。那么， DGPP 的形成只是降低 PA 水平的一种机制，还是 DG PP 作为信号分子起作用呢？有待于进一步证 实。近年来，参与磷脂信使物质之间转换的脂类 激酶和磷酸酶的研究很受关注。这两类酶通过对 磷脂信使物质的磷酸化和脱磷酸化作用调节其功 能，类似于蛋白质激酶和磷酸酶对蛋白质功能的 调节。植物中 DAG 激酶已经被克隆(Kat agi ri 等1996)。将 PA 信号转化成 DGPP 的 PA 激酶的特征 已经清楚(Wissing 和 Behrbohm 1993)，但是它的 编码基因还未找到。脂类磷酸酶的研究也取得了 较大的进展。它们存在着结构和催化特性不同的 两个主要

23、类型(Waggoner 等 1999)。类型 I (PAP-1)需要 Mg 2+ 激活，在三酰甘油酯合成中有重要作用；类型 II (PAP-2)不需要 Mg2+ 激活，可能参与 信号转导。PAP-2 是能够水解多种磷脂的磷酸酶家族，所以 PAP-2 家族成员又被命名为磷脂磷酸 酶(L PP ) 。LPP 有多种，其中 LP P- 1 、LPP - 2 和 LPP-3 能够对 PA、LysoPA、DGPP、神经酰胺 -1- 磷酸、神经鞘氨醇 -1- 磷酸等多种磷脂进行脱磷酸化。最近，类似于类型 II 的 PAP 基因已经在植 物上克隆(Marcel 等 2000)。磷脂信使物质之间能够相互转化，

24、每种信使 物质都可以由不同磷脂酶途径产生，这就引出磷 脂信号转导所涉及的分子种问题。因为并不是所有的 PA、DAG 和 lysoPL 都是化学上完全一致的，在它们的 sn-1 和 sn-2 位置上的酰基是不同的，因 而可以有许多不同的分子种。例如，PLD 的底物 PC 与 PLC 的底物 PIP2 的酰基组成不同，那么 PLC 水解 PIP2 产生的PA 与PLD 水解PC 产生的PA 就是 不同的分子种，而且产生于不同的亚细胞位置。 PA 的产生是通过PLC 途径还是PLD 途径可以通过 活体32P- 标记技术来定性区分(Munnik 等 1998a)， 也可以通过测定 PA 的脂肪酸组成进

25、行定量测定， 以明确 PLC 和 PLD 在 PA 形成中的贡献率。但是 目前还不清楚不同分子种的信使物质之间在它们的作用方面的差异。2.2PA 的下游事件在曾经做过测试的多种植物中均发现，受到 机械损伤后PA 的增加比LysoPL 和FFA (PLA2 的产 物)早(Lee 等 1997; Ryu 和 Wang 1998)。在拟南芥中，反义抑制 PL D 活性后，损伤引起的 PA 、游离的不饱和脂肪酸和茉莉酸的产生都减少, 说明PLD 激活后产生的 PA 刺激 PLA 活性增加。另外还 发现 JA 合成酶脂氧合酶 2(LOX2)的基因表达减少(Zien 等 2001)，说明 LOX2 可能是

26、 PA 的下游靶物，即 PA 通过激活 LOX2 促进 JA 的生成。另外，Sang等(2001b)在反义抑制拟南芥 PLD 后，观察到拟南芥叶片提取物中的 PA 和过氧化物水平均下降，外施 PA 则促进 PL D 缺失型植株过氧化物的生成，表明 PA 参与调节过氧化物的产生。大豆悬 浮培养细胞中，PA 引起一个被机械损伤激活的促 有丝分裂蛋白激酶(MAPK)的活性增加。用1- 丁醇 处理减少 PA 的形成，则抑制机械损伤对这种激酶 的激活(Lee 等 2003)。在大肠杆菌中表达的一种胡 萝卜的钙依赖蛋白激酶在离体条件下能够被PA和 Ca2+ 激活(Farmer 和 Choi 1999)。P

27、A 还影响离子通 道蛋白活性，如用 PA 处理保卫细胞原生质体，则 抑制内向性K通道蛋白活性(Lee等1996; Staxen等1999)。对植物中 PA 的下游反应或过程了解还很 少，这是限制揭示 PLD 细胞调节功能机制的主要 障碍。尽管动物 PLD 的作用只在 10 多年前才被认 识，动物上 PA 下游事件的研究已经远远领先于植 物。已经明确，PA 能够激活多种蛋白激酶，包 括蛋白激酶 C (PKC)、MAPK 和Raf 激酶(Cockcroft19 97 )。另外还发现，PA 能够激活 PIP-5 激酶和 PLC，这些都与磷脂信号转导有关。最近 Waite 等 (1997)报告，NAD

28、PH 氧化酶的一个亚基 p47-phox 是受 PA 激活的蛋白激酶的底物。植物 NADPH 氧 化酶复合体的同族体已经被鉴定，但是植物上的NADPH 氧化酶是否受PA直接激活还有待于证实。3PLD 作用的特异性PLD 家族内部、PLD 与其它磷脂酶及 Ca2+ 信使之间有交互作用，形成复杂的信号转导网络。这一网络在不同植物种类、器官、组织和细胞类型中表现出特异性，在不同胞外胁迫类型引起的细胞信号转导过程中也有差异。PLD 作用的特异 性包含在网络特异性中，如不同细胞信号转导过 程涉及的信号转导网络中，PLD 的类型及其与其 它磷脂酶以及 Ca2+ 信使之间的关系可能不同。3.1 各种 PLD

29、 功能的特异性近年来，人们通过反义抑制法成功地筛选到 拟南芥 PLD 的基因缺失突变体，使得几个 PLD 类型在逆境胁迫、激素反应、防御反应等方面的重 要功能不断被揭示。Fan 等(1997)用ABA 或乙烯处 理 PLD 活性受了反义抑制的拟南芥叶片，看到 激素诱导的衰老过程被明显延迟，说明 PLD 介 导 ABA 和乙烯信号转导过程。如果不经ABA 或乙烯处理，PL D 活性被反义抑制并没有影响植物的生长发育，说明 PLD 可能只介导胁迫诱导的 衰老过程，而不介导正常发育的程序化衰老。然 而，在 PLD 的细胞信号转导功能发现以前，人们 长期关注着 PLD 在植物的衰老、老化与机械损伤 时

30、的磷脂降解功能。那么，是哪一种 PLD 介导了程序化衰老过程中的磷脂降解，尚需进一步研究。Sang 等(2001a)观察到拟南芥 PLD 缺失株的 抗旱力较野生型的低。Welti 等(2002)的实验则证 明，PL D 缺失株的抗霜力较野生型明显地高。 一种 PLD 类型在两种胁迫条件下表现出截然相反 的作用，与 ABA 等逆境信号因子的作用不同。这 主要源于两种胁迫条件下PLD的作用机理方面的 差异。PL D 活性被反义抑制后，拟南芥叶片对 ABA 的敏感性下降，阻碍了水分缺失诱导的气孔 关闭，从而导致植株抗旱力下降。霜冻处理后， PL D 缺失株与野生型的膜脂组成变化不同， PLD 缺失株

31、的膜脂中 PC 含量的减少幅度仅是野 生型的一半，PA 的增加幅度也仅是野生型的一 半。PC 是对膜脂双分子层起稳定作用的磷脂，而PA 的积 累则促进低温胁迫下六角形 I I 相位 ( hax gonal II pha se) 的形成，从而破坏膜脂的结 构。所以，缺失型膜脂组成的这种变化有利于膜 脂双分子层的稳定，可能是植物抗寒力提高的主要机制。可见，在霜冻胁迫下 PLD 的作用机理可能较其它胁迫类型更为复杂和独特，因为在霜冻 胁迫下它的信号转导功能和磷脂降解功能同时发挥 作用。有趣的是，与 PLD 在拟南芥的抗冻性上 的作用相反，PLD 基因被敲除后，拟南芥抗冻性下降，PLD 的超表达则提高

32、了拟南芥的抗冻性，而且比 PLD 被反义抑制提高的效果更显著 (Li 等2004)。PLD 的功能也被发现。刘斌等(2002) 将 PLD 反义基因转入三倍体毛白杨后，转化株的 耐盐碱能力明显提高，在含盐量达 0.5% 的土壤环 境中仍可快速生长。PLD 被反义抑制后 PLD 和 PLD 的活性并 没有显著下降，但是 PLD 的缺失不能被 PLD 和PLD 补偿。van der Luit 等(2000)用普通激发子鞭 毛蛋白、壳四糖和木聚糖酶处理32P- 标记的番茄悬 浮培养细胞，发现 3 种激发子都能够激活 PLC 途 径，而且该途径是 PA 形成的主要贡献因子。但 是，这 3 种激发子中却

33、只有木聚糖酶能够激活PLD，壳四糖和鞭毛蛋白则不能。在已经克隆的5 种番茄 PLD 中，只有 PLD1 能够被木聚糖酶激 活(Laxalt 等 2001)。在番茄悬浮培养细胞中使该基 因沉默会导致木聚糖酶 -PLD 反应的丧失(Lax al t 等，个人通讯) ，说明是 PLD 1 对木聚糖酶处理 做出的反应。在动物界中只鉴定出两个类型，即PLD1 和 PLD2，PLD2 基因的超表达引起细胞骨架重组，而PLD1 的表达却不会引起细胞形态学上的 任何改变(Colley 等 1997)。Waksman 等(1997)在酵母中也鉴定出两个类型，即 PLD1 和 PLD2，并观察到 PLD1 参与减

34、数分裂过程, 而 PLD2 则不参与。这些均说明，不同的 PLD 在特定的细胞信号转导过程中执行独特的功能，彼此无法取代。 抗旱性强的更苏植物Craterostigma plantagine-um 在经脱水处理几分钟就可以检测到一种PLD 的 活性增加(Frank 等 2000)。但是外源 ABA 处理却不 能快速激活这一 PLD，尽管更苏植物的许多脱水 反应都能够被 ABA 诱导。脱水处理 2 h 以后，在这种植物中鉴定到的两种PLD中的一个的mRNA增加，这种作用能够被外施 ABA 诱导。利用抗旱 性不同的豇豆(Vigna unguiculata)品系进行的实验发 现，水分胁迫引起 PLD

35、 活性显著增加，尤其是对 干旱敏感的品种比抗旱品种更明显(El Maarouf 等1999)。在这个研究中，没有检测到 ABA 对 PLD表达的影响。保卫细胞和大麦糊粉层细胞在 ABA信号系统中都通过翻译后调节作用激活 PL D(Ritchie 和 Gilroy 1998；2000；Jacob 等 1999)。在离体和活体状态下用 ABA 处理糊粉层细胞原生质体，发现只有在处理后 10 min 时出现一个 PLD的活性高峰。但是在保卫细胞原生质中则有两个PLD 活性高峰，分别在处理 5 min 后和 20 min 后 出现。尽管这些反应中的 PLD 还未被鉴定，作用 也不明确，但却足以说明 P

36、LD 基因的表达在不同 植物种之间、不同细胞类型之间以及胞外信号类 型之间具有特异性。3.2 PLD 与 PLC 途径的交互作用及其特异性前面说过，PA 和 DAG 两种信使物质之间可 以相互转化，但是植物中缺少 DA G 下游靶物 PKC，DAG 可能在DAG 激酶的作用下迅速转化成 PA，作为信使物质将信号向下游转导，因而植物 中可能更多地利用 PA 作为信使物质(L ax al t 和 Munnik 2002)。PA 产生于 PLD 和 PLC 两条途径。这两条途径既可能平行作用，也可能串联在同一条途径上, 还可能单独作用。 在谷物种子萌发与幼苗生长初期，胚合成的GA 被释放到糊粉层，刺

37、激 - 淀粉酶等水解酶的 合成。这些水解酶被分泌到胚乳中后，引起储藏 的淀粉水解，最终产生植物可以直接吸收利用的单糖或者二糖，供种子萌发和幼苗生长。谷物糊粉层细胞是细胞信号转导研究的模式细胞之一。 Ritchie 和Gilroy(1998，2000)观察到ABA 处理能够 抵消糊粉层对GA 的反应。在实验体系中加入1- 丁 醇则可以清除ABA 的抑制作用。经微注射IP3 后没 有检测到胞内 Ca2+ 水平的增加，表明 PLC 途径没 有介入这一体系。所以，在糊粉层细胞中 ABA 只 激活 PLD 这一条途径。另外，由于在外施 ABA 后 可以迅速检测到 PA 生成，外施 PA 能够诱导这些 A

38、BA 反应，所以 PLD 被认为是这个调节网络中的 早期作用因素，与 AB A 受体接近。保卫细胞也是细胞信号转导研究的模式细 胞。在蚕豆保卫细胞的研究发现，ABA 处理能够引起气孔关闭和 K通道蛋白活性下降(J ac o b 等1999)。外施 PA 只能够诱发 ABA 直接处理引起的 反应的 50%。而用 PLD 抑制剂 1- 丁醇和 ABA 同时 处理蚕豆表皮细胞，也只减少 ABA 反应的 50%。 说明在蚕豆保卫细胞中 PLD 与其它信号转导途径 平行地传递ABA 信号。保卫细胞中介入ABA 信号转导的其它因素有 PLC (Staxen 等 1999)、六磷酸 肌醇(IP6, Lemt

39、iri-Chlieh 等 2000)和环 ADP 核糖 (cADPR, Leckie 等 1998)。Jacob 等(1999)用 1- 丁 醇与 PLC 抑制剂新霉素组合或者与 cADPR 抑制剂烟碱组合进行实验，结果是当 1- 丁醇与烟碱组合使用时，ABA 反应几乎被完全消除，而 1- 丁醇与新霉素组合使用时，ABA 反应仍有对照的 50。推测 PLD 与 PLC 链接在同一途径，而和与 cADPR有关的信号系统平行作用。 在根瘤菌上也观察到了类似的现象。根瘤菌分泌的结瘤因子脂壳寡糖刺激根瘤开始在寄主豆类 植物的根上形成。最初可以看到的反应是根毛弯曲变形。Den Hartog 等(2001

40、)在用32P- 标记的蚕豆 幼苗进行的实验中看到，结瘤因子迅速刺激 PA 的 形成。Munnik 等(1995, 1998a, b)应用转磷脂酰基 化方法和差异标记法研究表明，PLC 和 PLD 都参 与了 PA 的形成。如果用新霉素或者正丁醇预处理抑制其中一种磷脂酶的活性，根毛变形就受到抑制。用植物中 PLD 和 PLC 途径的有效激活因子黄 蜂毒素处理能够诱导根毛变形和结瘤基因的表达 (Den Hartog 等 2001)。不活跃的黄蜂毒素类似物 ma s 1 7 既不能诱导根毛变形，又不能引起 PA 形 成。这一结果表明，PLD 和 PLC 可能连接在同一 条信号转导途径上。因为如果是平

41、行作用，抑制其中一条途径，不会完全抑制根毛变形的发生。3.3PLD 与 Ca2+ 的关系PLD 和 Ca2+ 均介导保卫细胞和糊粉层细胞的ABA 信号转导(Blatt 2000; Schroeder 2001)。然而，ABA 处理后，在大量保卫细胞中并未检测到 Ca2+的增加，但气孔对 ABA 的反应却很正常(Romano 等 2000)，证明保卫细胞中存在不依赖Ca2+ 的ABA 信号转导途径。用 PLD 的抑制剂 1- 丁醇处理保卫 细胞，也只消除 AB A 对气孔开放的抑制作用的50% (J acob 等 1999)，说明保卫细胞中存在 PLD以外的 ABA 信号转导途径。但是，PLD

42、和 Ca2+ 是 怎样的关系呢？Romano等(2000)用PA处理保卫细 胞，但是并未检测到胞质 Ca2+ 浓度变化。这说明 PLD 与 Ca2+ 可能不在同一条途径上，如果在同一途径上，PLD 一定位于 Ca2+ 的下游。推测可能存 在 PLD 的翻译后修饰，如 Ca2+ 通过调节 CDPK 对 PLD 进行磷酸化作用，这还有待于证实。而在谷 物糊粉层细胞中，ABA 通过翻译后调节作用激活 PLD，产生的 PA 能够激活 ABA 诱导的基因，并 通过降低 Ca2+ 浓度，抵消GA 诱导的胞质Ca2+ 浓度 增加，从而抑制 - 淀粉酶的产生(Ritchie 和 Gilroy1998)。可见，

43、糊粉层细胞和保卫细胞都存在保守的 PLD 相关的 ABA 信号转导途径。然而细胞特异性反应出现在 PLD 和 Ca2+ 信号之间的关系上。在 保卫细胞中，PLD 介导不依赖 Ca2+ 的 ABA 信号转 导途径。在糊粉层细胞中，PA 通过降低 Ca 2+ 浓 度完成信号转导作用。甚至同一种磷脂酶的不同类型水解作用产生的信使物质，分子种不同，可能对下游靶物产生不同的 作用，目前尚未证实。但是，高度保守的反应 因素完全可能产生较大差异的细胞作用，如钙调 素(CaM)在蛋白质结构方面的微小差异可以导致对 下游调节作用上的巨大差异。因此，要阐明 PLD 的调节作用的机制，还需要弄清不同分子种的信 使物

44、质之间的作用的差异。随着研究结果的不断积累，人们终将通过遗 传操作、结构分析、基因组分析等方法手段，最 终弄清楚是哪一种 PLD 在哪一种细胞中对哪一种 处理做出反应，明确每个 PLD 在特定的细胞信号 转导网络中的具体位置，不但能够揭示 PLD 的细 胞信号转导作用及其机制，对于阐明植物生长与 发育过程中的磷脂信号转导途径也十分重要。4问题与展望对 PLD 的结构、生化特性与细胞信号转导功能的研究已经取得较大进展。蛋白质结构中 C2 域、PH 和 PX 域的存在，PLD 的复杂调控机制， 以及 PLD 作用的特异性研究揭示了 PLD 在细胞调 节方面的重要性与复杂性。要进一步了解 PLD 和

45、 磷脂信号转导，还需要攻克以下两个难题。一个是明确 PLD 在特定的细胞与生理过程中的功能。 PLD 基因敲除和获得反义转基因植物、一种或多 种 PLD 功能缺失的突变体等，都是解决这一问题 的有效途径。另外，随着各种 PLD 的分子生物学 方面的信息的增加，PL D 类型特异性的抗体和 DNA/RNA 探针将会出现，并成为解决这些问题的 有效工具。另一个难题是揭示 PLD 调节细胞反应 的机制。包含 PLD 的磷脂信号转导网络存在特异 性，说明 PLD 作用机制相当复杂。不同的磷脂信 号转导网络中 PA、DAG、LysoPA 和 FFA 等磷脂 信使物质在生成途径上有差异，这可能在调节信 使

46、物质的数量、位置、产生时间以及酰基组成方 面有重要作用(Hodgkin 等 1998)。磷脂信使物质的 产生位置是个关键因素，因为磷脂在细胞内的移 动十分有限。磷脂信使物质不但分布在不同的 膜，如质膜、内质网膜和核膜等膜上，还被区 隔在特定膜的某个区域里(Hooper 1999)。磷脂信 使物质产生的时间顺序在信号转导作用中也有其重 要意义。所以，需要明确不同 PLD 的时空表达、 细胞与组织定位。然而，目前还只对 PLD 了解 了一些这方面的信息。另外，还需要明确 PLD 和PA 直接的下游靶物。目前，对于 PA 、PA 衍生 出的信使物质以及磷脂水解产生的胆碱、乙醇胺等游离头部(free

47、head group)的下游反应或过程(激酶、磷酸酶、离子通道蛋白、结合蛋白以及其 它靶物)了解甚少。在ABA 和胁迫信号转导途径中 研究 PLD 有利于解决这一问题，因为这些过程中 的一些成分已经被鉴定了。此外，不同的磷脂酶参 考 文 献Abousalham A, Nari J, Teissere M, Ferte N, Noat G, Verger R (1997). Study of fatty acid specificity of su n flow er phospholipase D using detergent/phospholipid micelles.Eur J Biochem. 248: 374-379Au s t in -B r o w n S , C h a p m a n K D ( 200 2) . In hib it ion o f phospholipase D by N-acylethanolamines. Plant Physiol,129: 1892-1898Blatt MR (2000). Ca2+ signall