格列喹酮促进C2C12细胞摄取葡萄糖.doc

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1、格列喹酮促进C2C12细胞摄取葡萄糖文章来源 毕业论文网 1 引言胰岛素抵抗和β细胞功能缺陷是2 型糖尿病特征性病理生理学改变，其中胰岛素抵抗是2 型糖尿病的发病机制中一重要环节，胰岛素抵抗主要表现之一为胰岛素敏感组织(肌肉、脂肪组织)葡萄糖摄取减少。格列喹酮作为第二代磺脲类药物，其主要作用是通过促进胰岛素分泌而控制血糖。随着学者们对磺脲类药物作用机理研究的深入，格列喹酮经典途径以外的降糖机制也逐渐引起大家的关注。Rinninger F 等i研究发现，格列喹酮可通过诱导体外培养的肝脏细胞糖原合成增加而发挥胰腺外作用，Marco 等ii研究发现格列喹酮可诱导3T3-L1成纤维细胞PPA

2、Rγ 靶基因GLUT4 的表达，其作用效应与吡格列酮相近。本研究旨在通过体外葡萄糖摄取实验，观察格列喹酮对C2C12 细胞葡萄糖摄取作用及对胰岛素刺激的糖摄取的影响，并初步探讨格列喹酮的胰腺外降糖作用机制，为进一步阐明其临床作用提供新的实验依据。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 细胞株小鼠成肌细胞株(C2C12) ,由德国乌尔姆大学刘跃飞教授惠赠。2.1.2 主要试剂DMEM 培养基（Gibco 产品，高糖型），胎牛血清（杭州四季青公司），马血清（Gibco产品），胰蛋白酶、DEPC、溴化乙锭（Sigma 公司），Trizol（Invitrogen 公司），逆转录酶MMLV 酶

3、、Taq 酶（MBI 公司），GLUT4 及β-actin 引物由上海生工合成，100 bp LadderDNA Marker (Axyden 公司)，琼脂糖（Gibco 公司），3H -2-脱氧葡萄糖（Amersham 产品），格列喹酮（北京万辉双鹤药业），其它试剂均为国产分析纯。2.2 方法2.2.1 C2C12 的培养加入含 10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于37、含5CO2 的培养箱中培养，隔日换液，待细胞生长至7080融合时按1：4 传代。2.2.2 C2C12 诱导分化C2C12 细胞达80%左右融合时，传代接种于干预板中，待生长至80%90%融合时，换用分化培养基（

4、含2%马血清的DMEM 培养基）诱导分化(day0)，每24 小时换液一次；5-7天后90%以上成为成熟骨骼肌细胞用于实验。2.2.3 葡萄糖氧化酶法检测细胞培养基中葡萄糖水平细胞接种于 6 孔板，给药组在细胞分化后分别加入含10-5mol/L 的格列喹酮、10-7mol/L胰岛素以及10-5mol/L 格列喹酮+10-7mol/L 胰岛素的DMEM，同时设立空白组、不含细胞的DMEM 组。温育12 h 后再将培养基移出并用葡萄糖氧化酶法检测培养基中的含糖量。用DMEM 组含糖量的平均值减去其余各孔的含糖量，即是12h 各孔细胞的葡萄糖消耗量。收集细胞提取总RNA。2.2.4 采用四甲基偶氮唑

5、盐法评估格列喹酮对C2C12 细胞增殖的影响取体外培养的C2C12 细胞，0.25%的胰酶溶液消化，制成单细胞悬液，1000 r/min 离心5min，以含10胎牛血清的DMEM 培养基重悬。血细胞计数板进行细胞计数，细胞悬液密度为3.4×106 /L，接种至96 孔板，200μL/孔。实验共分4 组：空白对照组、10-7mol/L 胰岛素组、10-5mol/L 格列喹酮组、格列喹酮+胰岛素组，6 个平行孔/组。各组在37、5CO2细胞培养箱内常规培养。待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时，药物组分别向C2C12细胞中加入含对应浓度药物的无血清培养基，空白对照组则向C2C1

6、2 细胞中加入单纯无血清培养基。各组细胞干预12 h 后进行四甲基偶氮唑盐检测。即每孔加入5mg/mL 的四甲基偶氮唑盐液20μL，37继续培养4 h，镜下可见紫蓝色针状结晶。吸出孔内培养基后，每孔加入二甲基亚砜200μL，室温下将平板置于微孔板振荡器上振荡10 min，待结晶物溶解后，置于酶联免疫仪于490 nm 处检测各孔吸光度值。2.2.5 3H -2-脱氧葡萄糖摄取实验细胞接种于 24 孔板，给药组在细胞分化后分别加入含 10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L格列本脲的DMEM，同时设立空白组。用KRP 缓冲液洗涤3 次后，加入含10-7mol/L 胰岛素的KR

7、P 缓冲液，在37继续培养30min，然后加入3H -2-脱氧葡萄糖，使终浓度为3.7×104Bq/L，作用15 min 后，用冷PBS 洗涤3 次，用0.1mol/L 的NaOH 裂解细胞，取细胞裂解液用液闪仪计数其每分钟计数(CPM)。每一样本测定的CPM 值用与对照组的比例表示。2.2.6 RT-PCR 法检测GLUT4 mRNA 表达采用 Trizol 一步法提取各组细胞的总RNA，经紫外分光光度计测定RNA 的A260nm 与A280nm 比值在1.601.90 之间。取4μl 总RNA 为模板逆转录，根据文献，并与从Gene Bank上下载的人GLUT4 mRNA

8、、β-actin mRNA 核苷酸序列核对，由上海生工合成GLUT4 和β-actin 单核酸引物。GLUT4 上游: 5’- gcccgaaagagtctaaagcg -3’ ， 下游: 5’-actaagagcaccgagaccaa-3’，扩增产物长312bp。β-actin 上游:5’- cgtgcgtgacattaaagag -3’，下游: 5’-ctggaaggtggacagtgag- 3’，扩增产物长435bp。扩增条件: 95 5min 预变性，然后95

9、45s，58 45s，72 45s 进行35 个循环，再以72延伸10min，再以72延伸10min。反应完成后取5μl PCR 产物于2%琼脂糖凝胶（含0.5mg/ L 溴化乙锭）电泳，用Sensicapture 自动凝胶成像分析仪扫描凝胶图谱，LabImage 分析软件对RNA 条带进行分析，得出GLUT4 与内参照条带β-actin 的吸光度比值，比较各组GLUT4mRNA 相对表达情况。2.3 统计学处理应用 SPSS 13.0 软件包对实验数据进行统计，所有数据都用?x±s 表示，采用one-wayANOVA 进行显著性检验，组间比较采用S-N-K 检验

10、，以P < 0.05 为差异有统计学意义。3 结果3.1 格列喹酮对C2C12 细胞培养基中葡萄糖消耗的影响结果显示，干预12h 后，胰岛素组C2C12 细胞葡萄糖消耗量明显增加，高于空白组（12.34±0.55 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮组细胞耗糖量亦明显增加（10.95±0.46 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮+胰岛素组细胞耗糖量较胰岛素组增多（13.77±0.73 vs 12.34±0.55，P<0.01）。3.2 格列喹酮对C2C12

11、细胞增殖的影响四甲基偶氮唑盐检测结果表明，细胞处理12 h 后，与空白组比较, 胰岛素组、格列喹酮+胰岛素组平均吸光度值均显著增加（0.74±0.09，0.76±0.09 vs 0.54±0.06，P<0.01），而格列喹酮组平均吸光度值无明显变化（0.55±0.089 vs 0.52±0.063，P>0.05）。3.3 格列喹酮对C2C12 细胞葡萄糖摄取的影响C2C12 细胞在基础状态下对葡萄糖有一定的摄取，胰岛素刺激可使细胞葡萄糖摄取增加（为空白组的1.68±0.09 倍，P<0.01）

12、；10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L 格列本脲孵育细胞12h 后，与空白组相比，细胞对葡萄糖的摄取均增加（分别为1.52±0.23 倍、1.23±0.16 倍，P<0.01）；与格列苯脲相比，格列喹酮组细胞葡萄糖摄取增高更明显（P<0.01）；在胰岛素存在的情况下，格列喹酮组细胞葡萄糖摄取明显增加（为空白组的1.93±0.12 倍，P<0.01），且高于胰岛素组（P<0.01），见格列喹酮对C2C12 细胞葡萄糖摄取的影响。3.4 格列喹酮对C2C12 细胞GLUT4 mRNA 表达的影响胰岛素和格列喹酮干预C2C12 细胞12 小时结果显示，胰岛素组GLUT4 mRNA 表达高于空白组（0.73±0.04 vs 0.47±0.02，P<0.01），格列喹酮组GLUT4 mRNA 表达与空白组