分子荧光分析法.ppt

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1、第三章 分子荧光分析法Chapter 3 Molecular Fluorescence,学习要求,掌握分子荧光的产生、基本概念及定量分析应用,掌握紫外-可见分光光度计的组成、功能及使用,掌握荧光分子的结构特征及影响溶液荧光的因素,2008年诺贝尔化学奖,下村修现年80岁的下村修1928年出生于日本京都府，1960年获得名古屋大学理学博士学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。他1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。,马丁沙尔菲马丁沙尔菲出生于1947年，现年61岁，是美国哥伦比亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧

2、光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。,瑞典皇家科学院8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家马丁沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学奖，将均分1000万瑞典克朗（约合140万美元）奖金。帮助他们获奖的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实验带来革命，它发出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞层面的诸多反应。,由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息之中，让其随着这些需要跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症对大

3、脑造成的损害、观察有害细菌的生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何产生分泌胰岛素的细胞。,某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物 萤石(fluospar)而得名。我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光。除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光，因此除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光等。,用荧光抗体染色之原生动物,澳大利亚科学家最新发现，一种叫“螳螂虾”的海里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配

4、偶，,K.Brejc et.al.,PNAS 94(1997)2306,green-fluorescent protein(GFP),概述,一、分子荧光,化合物分子吸收电磁波并发射出另一波长电磁波,概述,一、分子荧光,化合物分子吸收电磁波并发射出另一波长电磁波,二、分子荧光分析法,利用物质分子的荧光进行分析测定的方法,lex、I0,lem、If,lex、I,激发光,发射光,透射光,三、分子荧光分析法特点,灵敏度高、选择性好；影响因素较多,什么结构的化合物具有分子荧光？基本原理分子荧光如何测量？荧光分光光度计分子荧光法有何应用？分子荧光分析法应用,概述,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生二、激

5、发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系四、影响荧光强度的因素,一、分子荧光的产生-光致激发,分子中基态电子激发后失活的可能方式,一、分子荧光的产生,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,非辐射跃迁振动驰豫内转换外转换系间跨越,激发单重态,激发三重态,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,辐射跃迁荧光发射磷光发射,振动驰豫：通过分子间的碰撞，激发态分子失去其振动能量，失活到同一电子能级的较低振动能层。,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,非辐射跃迁振动驰豫内转换外转换系间跨越,激发单重态,激发三重态,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,辐射跃迁荧光发射磷光发射,内转换：发生在相同多重态之间，

6、通过振动能层间的重叠，激发态分子由较高电子能级失活到较低电子能级的较高振动能层。,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,非辐射跃迁振动驰豫内转换外转换系间跨越,激发单重态,激发三重态,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,辐射跃迁荧光发射磷光发射,外转换：激发态分子通过与其它分子的相互作用而转移能量的过程。,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,非辐射跃迁振动驰豫内转换外转换系间跨越,激发单重态,激发三重态,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,辐射跃迁荧光发射磷光发射,系间跨越：不同多重态间，通过振动能层重叠的无辐射跃迁。,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,非辐射跃迁振动驰豫内转换外转换系间

7、跨越,激发单重态,激发三重态,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,辐射跃迁荧光发射磷光发射,荧光发射：第一单重激发态最低振动能层的电子，发射光子返回基态。,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,非辐射跃迁振动驰豫内转换外转换系间跨越,激发单重态,激发三重态,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,辐射跃迁荧光发射磷光发射,磷光发射：第三重激发态最低振动能层的电子，发射光子返回基态。,荧光与磷光的区别？,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,非辐射跃迁振动驰豫内转换外转换系间跨越,激发单重态,激发三重态,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,辐射跃迁荧光发射磷光发射,荧光分子吸收电磁波由基态跃迁至激发

8、单重态，通过振动驰豫、内转换等失去部分能量回到第一激发单重态的最低振动能层，然后，发射电磁波失活到基态，从而产生分子荧光,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,1.激发光谱,荧光强度与激发光波长间的关系曲线。,激发光波长：,最大激发波长 lex,与紫外吸收光谱一致,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,1.激发光谱,荧光强度与激发光波长间的关系曲线。,激发光波长：,最大激发波长 lex,2.发射光谱,荧光强度与发射光波长间的关系曲线。,发射光波长：,最大发射波长 lem,与激

9、发光波长无关,Stokes位移,镜像规则,1.分子荧光产生的必备条件,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,最大激发波长 lex,最大发射波长 lem,三、分子荧光与浓度间的关系,分子必须能够吸收激发光,分子必须具有一定的荧光量子产率,与激发态分子失活过程的速率常数有关,发射过程中的速率常数,其他过程有关的速率常数，主要取决于环境,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,最大激发波长 lex,最大发射波长 lem,三、分子荧光与浓度间的关系,荧光量子产率jf,1.分子荧光产生的

10、必备条件,2.分子荧光与浓度间的关系,A0.05,若,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,最大激发波长 lex,最大发射波长 lem,三、分子荧光与浓度间的关系,A0.05,四、影响荧光强度的因素,1.荧光与分子结构的关系,a.跃迁类型,p*p 跃迁荧光效率较高。,b.共轭效应,共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。,0.07,0.18,0.93,0.27,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,最大激发波长 lex,最大发射波长 lem,三、分子荧光与浓度间的关系,A0.0

11、5,四、影响荧光强度的因素,1.荧光与分子结构的关系,a.跃迁类型,p*p 跃迁荧光效率较高。,b.共轭效应,共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。,c.刚性平面结构,0.18,1,供电子基团：增强；吸电子基团：减弱。重原子效应：荧光减弱、磷光增强。,d.取代基效应,0.16,0.05,0.01,0,吸电子集团 比较强的是：,-COOH,-NO2,-NH3+-CHO,-COOR,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,最大激发波长 lex,最大发射波长 lem,三、分子荧光与浓度间的关系,A0.05,四、影响荧光强度的因素,1.荧光与分

12、子结构的关系,共轭、刚性平面、取代基,2.荧光与环境因素的关系,a.温度影响,温度升高，荧光减弱；温度降低，荧光增强,b.pH影响,改变含有酸碱官能团分子的结构,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,最大激发波长 lex,最大发射波长 lem,三、分子荧光与浓度间的关系,A0.05,四、影响荧光强度的因素,1.荧光与分子结构的关系,共轭、刚性平面、取代基,2.荧光与环境因素的关系,a.温度影响,温度升高，荧光减弱；温度降低，荧光增强,b.pH影响,改变含有酸碱官能团分子的结构,溶剂与分子轨道发生作用，改变跃迁能量,特殊作用：氢键、改变

13、荧光物质解离状态,c.溶剂影响,d.溶液黏度,黏度升高，荧光增强,e.溶解氧,降低溶液荧光增强,第一节 基本原理,一、分子荧光的产生,光致激发,非辐射跃迁失活,辐射跃迁,二、激发光谱和发射光谱,最大激发波长 lex,最大发射波长 lem,三、分子荧光与浓度间的关系,A0.05,四、影响荧光强度的因素,1.荧光与分子结构的关系,共轭、刚性平面、取代基,2.荧光与环境因素的关系,温度、pH、溶剂、黏度、溶解氧,3.荧光熄灭或猝灭,激发态分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低甚至消失的现象,问题讨论,分子荧光产生过程如何？什么结构的化合物可能具有较强荧光？什么条件下测量可能得到较大的荧光值？,第二

14、节 荧光光谱仪,一、荧光光谱仪的基本结构二、荧光光谱仪的主要部件,第二节 荧光光谱仪,一、荧光光谱仪的基本结构,荧光光谱仪与紫外-可见分光光度计光路设计有什么区别？,二、荧光光谱仪的主要部件,为荧光测定提供足够强度的、稳定的激发光氙灯、高压汞灯,将光源发出的复合光分解为单色光光栅、滤光片,盛放试样石英、四面透光,将荧光物质产生的荧光分解为单色光光栅、滤光片,将荧光信号转换为电学信号灵敏光电倍增管,第二节 荧光光谱仪,一、荧光光谱仪的基本结构,第三节 分子荧光分析法应用,一、荧光定量分析二、荧光分析法的应用,第三节 分子荧光分析法应用,一、荧光定量分析,标准曲线法,标准对比法,定量依据,定量方法

15、,A0.05,二、荧光分析法的应用,无机物分析,与有机试剂配合物后测量；可测60多种元素。,铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定,第三节 分子荧光分析法应用,一、荧光定量分析,标准曲线法,标准对比法,定量依据,定量方法,A0.05,二、荧光分析法的应用,无机物分析,与有机试剂配合物后测量；可测60多种元素。,第三节 分子荧光分析法应用,一、荧光定量分析,标准曲线法,标准对比法,定量依据,定量方法,A0.05,二、荧光分析法的应

16、用,无机物分析,与有机试剂配合物后测量；可测60多种元素。,生物及有机物分析,分子荧光法课堂练习,1.化合物分子吸收电磁波激发到电子激发态，处于激发态的分子不稳定，通过 和 方式失活回到基态。荧光分子从第一激发单重态的 能层释放电磁波返回基态，产生分子荧光。,2.荧光激发光谱，可用于确定荧光分析时的；荧光发射光谱，可用于确定荧光分析时的。,3.荧光量子产率为 与 之比。下列各对化合物中荧光量子产率较高的分别是(1)(2)(3)(4)。,4.与紫外分光光度计比较，荧光光谱仪光源强度更，激发光路与发射光路呈，比色皿。,5.分子荧光法测量灵敏度高的主要原因为分子荧光是在 背景下测量的。,问题讨论,与

17、紫外-可见分光光度计比较，荧光光度计有何特点？分子荧光法具有哪些的优点和缺点，为什么？如何确定荧光定量分析的激发和发射光波长？,一、什么是分子荧光法？881.什么是分子荧光法？什么是分子荧光？二、什么物质可以用分子荧光法测定？88-932.分子荧光或磷光是如何产生的？3.何为振动驰豫、内转换、外转换、系间跨越、荧光发射、磷光发射？4.什么是荧光激发光谱？什么是荧光发射光谱？各有何特点和作用？5.为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？6.何谓Stokes位移？Stokes位移是如何产生的？何为镜像规则？7.分子产生荧光的必备条件是什么？8.什么是荧光量子产率？什么样结构的化合物荧光量子产率高？三、分子荧光法定量关系式如何？93-959.荧光强度与样品浓度间关系如何？该关系式成立的条件是什么？10.影响溶液荧光强度的因素有哪些？如何影响？何为荧光猝灭？四、分子荧光法是如何测量的？95-9611.分子荧光光谱仪部分功能如何？与UV-Vis有何不同？12.分子荧光光谱仪的激发和发射光路为何设计呈直角？13.分子荧光分析法有何特点？五、分子荧光法是如何进行定性定量分析的？97-9914.分子荧光分析法有哪些主要定量方法？如何操作和计算？,