[医学]第一章 核酸与分子标志物.ppt

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1、第 一 章核酸与分子标志物,专业培养目标,培养学生具有扎实的分子生物学理论基础,（2）了解本学科的前沿领域和发展趋势,（1）掌握本学科的基础理论和基本技能,临床分子生物学检验,考 试,考试多途径考核,绪论,第一节 临床分子生物学检验的定义及其发展,研究对象：生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等研究目的：阐明各种生命现象的本质研究技术：克隆、扩增、测序、杂交、电泳等,分子生物学,四个阶段：,一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心,第二节 临床分子生物学检验靶标及其应用,广义：分子标志物包括:基

2、因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA）为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标,一、病原生物基因,1.菌种鉴定：PCR测序和PCR-DNA探针杂交;缩短检测时间 2.确定病毒感染和病毒载量：明确感染源，判断病情，检测疗效3.病毒分析：基因型变异产生不同临床症状4.细菌耐药监测和分子流行病学调查：随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播,二、基因变异,1.致病基因的分子缺陷2.线粒体基因突变3.肿瘤相关基因,1.致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不

3、良等。2.致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。,1.致病基因的分子缺陷单基因病,血友病及其基因变异,杜氏营养不良,临床表现：横纹肌萎缩，腓肠肌假性肥大发病原因：抗肌萎缩蛋白基因内部发生缺失，重复或点突变,临床表现：出血发病原因：血友病甲、乙的基因缺失分别在凝血因子，基因中,参与多基因病发生的基因被称为疾病相关基因。多基因病的发生涉及诸多因素，某一因素的变异不足以解释多基因病的发病机制。,多基因病,病种：精神神经疾病，高血压病，糖尿病，某些先天畸形等发病原因：多基因，多因素共同作用,多基因表型：身高,先天性巨结肠,2.线粒体基因突变,线粒体D

4、NA突变使线粒体功能发生障碍，直接影响人体组织和细胞的各种生物学功能，导致线粒体 遗传病。它具有母系遗传、基因突变具有阈值效应以及多系统受累等遗传学特征。,3.肿瘤相关基因,肿瘤的发生是由多种致癌因素综合作用的结果。与肿瘤发生相关的基因称为肿瘤相关基因，包括癌基因和抑癌基因。,包括病毒癌基因和细胞癌基因,它们具有潜在诱导细胞恶性转化的特征。,癌基因,抑癌基因,是存在于正常细胞内的一类可以抑制细胞生长的基因，具有潜在抑癌作用。,三、基因多态性,1.基因定位和疾病相关性分析：将致病基因定位于染色体相应位点，分析遗传标志与疾病的关联程度,2.疾病诊断和遗传咨询：胎儿产前诊断；遗传疾病风险评估,3.多

5、基因病的研究：检测基因多态性，了解疾病发生机制，疾病分类等,4.器官移植配型和个体识别：器官移植前HLA配型等,DNA指纹用于罪犯识别,DNA指纹用于亲子鉴定,四、循环游离核酸1、循环游离核酸与肿瘤2、循环游离核酸与产前诊断3、循环microRNA与肿瘤诊断,第三节 临床分子生物学检验发展与应用,一、临床分子生物学检验与感染性疾病诊断与治疗二、遗传性疾病的临床分子生物学检验三、肿瘤的临床分子生物学检验四、临床分子生物学检验与个体化医学,人类基因组计划是由美国能源部和NIH(national institutes of heath)联合做出的，1990年10开始，争取在15年内完成的目标：鉴定人

6、体DNA估计约8万个基因，测序构成人DNA的30亿个碱基，贮存这些信息于databases(数据库)并发展data analysis的工具.实际包括两部分工作:一是 mapping，一是sequencing。中国：重点是研究我们特有的致病基因的图谱和定序。,人类基因组计划（human genome project,HGP）,人类基因组计划的启动美国于1990年10月启动“人类基因组计划”欧洲、日本、韩国、俄罗斯、澳大利亚和中国相继加入人类基因组计划的研究行列,中国于1994年启动中国人类基因组计划最初的经费来源:国家自然科学基金委员会“863”高科技计划最初的研究项目:中华民族基因组中若干位点

7、基因结构的研究重大疾病相关基因定位、克隆、结构与功能研究,1999年9月1日，在国际基因组计划第5次战略会议（伦敦）上，争取到第3号染色体短臂上3000万bp的测序任务。首要条件之一：中国要遵守“百慕大原则”，即HGP的精神，所有合格的数据都应在24小时内上网。至此占世界人口20%的中国负责测定HG中的1%序列，成为第6个参加HGP实质性工作的国家。在30亿bp的测序上，美国承担54%。英国33%，日本7%，法国2.8%，德国2.2%。中国要在仅有的8个月内完成相当于德国的一半，法国的三分之一的工作量。设立的HGP中国实验室对外称呼：“华大基因研究中心”。结果，仅用半年时间，于2000年4月底

8、超额完成了3000万bp的“工作框架图“。,同日，美国总统Clinton和英国首相Blair代表美、英、法、德、日本和中国等六国发表声明：国际HGP和Celera基因公司完成的HG工作及相关成果属于全人类共享的资源和财富。2002年1月，由中国、日本、美国、德国和韩国等合作项目“智能基因的探索”，构建了人与黑猩猩对比的基因组（包括6.4万个DNA片段）物理图谱。对比过程中发现：两者碱基排列98.77%完全相同，差异只占1.23%。这只有1.23%的基因，却藏着人的智慧和能力的秘密，使人与猩猩如此不同,2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因

9、组计划的所有目标全部实现已完成的序列图覆盖人类基因组的99%，精确率达到99.99%，进度比原计划提前两年多2004年10月，公布人类基因组完成图,第一章 核酸与分子标志物,教学内容,教学目的与要求,第一节 核酸的结构与功能,核酸(nucleic acid)以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸 RNA（Ribonucleic acid)核糖核酸,元素组成,主要元素组成：C、H、O、N、P(9-11%),与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。,基本构成单位：核苷酸(nucleotide)

10、,核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成,碱 基,嘌呤(purine),核酸中核苷酸的连接方式,一、DNA的结构与功能 Structure and Function of DNA,（一）DNA的组成（二）DNA的结构与功能（三）DNA双螺旋结构的变异（四）DNA功能与分析技术,一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。,DNA的一级结构,1.两条链反向平行，围绕同一中心轴构成右手双螺旋(double helix)。螺旋直径2nm，表面有大沟和小沟。2.磷酸-脱氧核糖骨架位于螺旋外侧，碱基垂直于螺旋轴而伸入内侧。每圈螺旋含10个碱基对(bp)，螺距为3.4

11、nm。,二级结构：双螺旋结构模型(double helix model),3.两条链通过碱基间的氢键相连，A对T有两个氢键，C对G有三个氢键，这种A-T、C-G配对的规律，称为碱基互补规则。4.维持双螺旋稳定的因素：横向为氢键，纵向为碱基间的堆积力。,DNA的超级结构,（一）DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由

12、DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,5.5nm,串珠状核小体,DNA双螺旋片段,染色质纤维,伸展形染色质片段,密集形染色质片段,整个染色体,（四）DNA功能与分析技术,DNA分析技术：包括传统的DNA提取、分离和纯化，PCR扩增、限制性内切酶和杂交分析，以及发展迅速的基因芯片和DNA测序技术。,二、RNA的结构与功能,Structure and Function of RNA,中心法则（genetic central dogma）,三联体密码,（一）RNA的组成与分类（二）RNA的结构和功能,*tRNA的一级结构特点 含 10-20%稀有碱基，如 DHU 3末端

13、为-CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC,1、tRNA的结构与功能,双氢尿嘧啶(DHU),假尿嘧啶(),次黄嘌呤(I),*tRNA的二级结构三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,真核生物mRNA的结构特点,1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷二磷酸基，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,帽子结构

14、和多聚A尾的功能,OCH3,mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,3、核糖体RNA的结构与功能,*rRNA的功能参与组成核糖体，作为蛋白质生物合成的场所。,rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA,原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA,miRNA是一组短小、本身不具有开放阅读框架、长度为20-25个核苷酸的序列，它的3端可有两个碱基，5端有一个磷酸基团，具有高度保守性、时序性和组织特异性。,4、微RNA（miRNA）,（三）RNA

15、分析技术 RNA分离提取、纯化、定量与鉴定等 RNA表达检测一般先逆转录成为cDNA，再进行检测。,第二节 基因的结构与功能,基因的定义基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。,将编码蛋白质的基因根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为三类。具有转录和翻译功能；只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因；不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因。,一、基因的结构与功能（一）、原核生物的基因结构（二）、真核生物的基因结构,（一）原核生物的基因结构,操纵子(operon)机制,乳糖操纵子的结构,Z：-半乳糖苷酶基

16、因Y：透酶基因A：乙酰基转移酶基因,I：调节基因P：启动序列O：操纵序列,基因簇（gene cluster）,2、终止子：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。,3、操纵元件（操纵序列）阻遏蛋白(repressor)的结合位点,当操纵序列结合有阻遏蛋白时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻碍转录。,真核生物断裂基因结构示意图,（二）真核生物的基因结构,顺式作用元件,反式作用因子,mRNA,启动子(promotor):真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转

17、录起始点以及一个以上的功能组件,增强子（enhancer)：远离转录起始点，决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列。其发挥作用的方式通常无专一性,与方向、距离无关。沉默子（silencer）：负性调节元件远离顺式作用元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。,三、基因突变,基因突变：具有遗传效应的DNA分子上特定的核苷酸的序列发生改变，导致遗传效应发生相应变化。（一）点突变：错义突变、无义突变、RNA加工突变（二）插入或缺失突变：移码突变（三）动态突变：短串联重复序列重复次数增加,Missense mutation（错义突变）：These point muta

18、tions involve the alteration of a single base which changes a codon such that the encoded amino acid is altered.密码子的第一、二位碱基改变导致对应的氨基酸改变,镰刀型细胞贫血症:Glu-Val,Nonsense mutation（无义突变）：Nonsense mutation create stop codons（UAA/UAG/UGA）and produce shortened polypeptides 蛋白质合成提前终止，产生不完整的、无正常活性肽链,Frameshift mut

19、ation（移码突变）：Frameshift mutations involve insertion or deletion of a base producing an altered reading frame.Frameshift mutations usually have a serious effect on the encoded protein and are associated with mutant phenotypes.,e.g.ATG TTT CCC AAA GGG TTT-CCC TAG TAC AAA GGG TTT CCC AAA-GGG ATCmRNA AUG

20、 UUU CCC AAA GGG UUU-CCC UAG(终止)Pro.MetPhePro LysGlyPhe-Pro 甲硫 苯丙 脯 赖 甘 苯丙-脯增加A/T bp ATG ATT TCC CAA AGG GTT T-TAC TAA AGG GTT TCC CAA A-mRNA AUG AUU UCC CAA AGG GUU U-Pro.MetIle-SerGln ArgVal-甲硫 异亮 丝 谷氨酰胺 精 缬-,第三节 基因组结构与特征,两个重要概念：基因组（genome）：一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。基因（gene）：基因组中一个功能性遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链信息、

21、RNA序列信 息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。,一、原核生物基因组,（一）原核生物基因组特征（二）质粒（三）转座因子,（一）原核生物基因组特征,什么是原核生物（prokaryote）？细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体。,1、原核生物基因组DNA较小：一般在106-107bp之间，大肠杆菌基因组DNA由4.6106 bp组成，是人类基因组3109bp的1。基因数目较少，约含3500个基因，原核生物基因组中只有一个DNA复制起点2.原核生物的类核结构 原核生物没有典型的细胞核结构，基因组DNA位于细胞中央的核区，无核膜将其与细胞质

22、隔开，但能在蛋白质的协助下，以一定的组织形式盘曲、折叠包装，形成类核（nucleoid），也称拟核。,3.原核生物的操纵子结构 操纵子结构是原核生物基因组的功能单位 原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。结构基因连同其上游的调控区（包括调节基因、启动基因和操纵基因）以及下游的转录终止信号，共同组成了一个基因表达单位，即操纵子（operon）结构。,什么是多顺反子mRNA分子?一个mRNA分子带有几种蛋白质的遗传信息。利用共同的启动子和终止信号，转录的mRNA分子可以编码几种不同的、但多为功能相关的蛋白质。,4.原核生物的结构基因 基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列称为

23、结构基因。结构基因中没有内含子，基因是连续的，RNA被合成后不需要经过剪接加工。,5.具有编码同工酶的基因6.含有可移动DNA序列,（二）质粒,什么是质粒(plasmid)?细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。质粒命名的原则 用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称,pUC18,plasmid,编号,发现者名字,质粒具有不兼容性,质粒的分类复制机制 严紧型 松弛型功能 F质粒 R质粒 Col质粒转移方式 接合型 可移动型 自传递型大小 小型(1.5kb-15kb)大型(60kb-120kb)宿主范围 窄宿主谱型 广宿主谱型,质粒

24、的选择性标记 抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属基因。最常见的选择性标记是抗药性基因，即带有一种 或多种抗生素的抗性基因，可赋予宿主菌抵抗某种抗 生素的能力。,（三）转座因子,转座因子又称转座元件（transposable element），是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。,包括：插入序列（insertion sequence,IS)转座子(transposon,Tn)噬菌体(Mu)：具有转座功能的温和性噬菌体，能整合到宿主基因组内,1940s,美国冷泉港实验室(Cold Spring Harber Lab)的女科学家B.McClintock(荣

25、获1983年若贝尔生物医学奖)在玉米中首次发现.,1.插入序列(insertion sequence，IS)一个转位酶基因及其两侧的反向重复序列，长度为700-2 000bp。,共同特征:,A:两末端均有一段反向重复序列(IR,长度 不一定相同.B:一般只编码一种转位酶.C:插入后可在两侧形成顺向重复序列.D:可双向插入:正向,反向.,2.转座子(transposon，Tn)具有转座酶基因、抗性基因，大小为4.500-20kbp。,病毒 自然界普遍存在的一种结构简单、不能单独繁殖，只能在宿主细胞内进行复制以保证遗传信息传递的微生物。完整的病毒颗粒是由核酸和蛋白质组成。,二 病毒基因组,（一）病

26、毒基因组特征,1.基因组的碱基组成,2.基因组核酸类型,3.基因组中有基因重叠现象,4.基因组中具有操纵子结构,5.病毒基因可连续也可间断,6.基因组中重复序列少,7.基因组中非编码区少 8.基因组是单倍体 9.相关基因丛集 10.病毒基因组含有不规则结构基因，转录出多种mRNA分子。,1.基因组的碱基组成 病毒基因组结构相对简单，基因数少，所含信息量少，不同病毒的基因组大小有较大差异。,2.基因组核酸类型 双链DNA；单链DNA 双链RNA；单链RNA 环状分子；线性分子,什么是正链病毒？什么是负链病毒？如果基因组序列与mRNA相同，称为正链DNA(+DNA)或正链RNA(+RNA)病毒。如

27、果与mRNA互补，则称为负链DNA(-DNA)或负链RNA(-RNA)病毒。,单链正链RNA病毒基因组可直接作为模板功能，翻译出所编码的蛋白质，并复制出病毒核酸，自我组装成为成熟的病毒颗粒，感染宿主细胞。单链负链RNA病毒基因组不能直接作为模板功能，先以基因组RNA为模板转录生成互补RNA，然后以这个互补的RNA为模板，翻译出所编码的蛋白质。,3.基因组中有基因重叠现象 这种结构的意义在于使较小的基因组能携带较多的遗传信息，使病毒利用有限的基因，编码更多的蛋白质。,4.基因组中具有操纵子结构 噬菌体174是单链DNA病毒，含A、A*、B、C、D、E、F、G、H、J及K共11个蛋白质基因，但这些

28、基因却只能转录成3个mRNA，其中一个从A基因开始，一个从B基因开始，另一个从D基因开始。,1.DNA病毒基因组:以双链DNA为常见 2.转录模板：DNA病毒的基因组中，不同基因可以不同的链作为转录模板3.细胞核内复制：几乎所有真核DNA病毒都是在活宿主细胞核内复制 4.致病性：较大的双链DNA病毒可引起多种严重疾病，而较小的DNA病毒会在宿主体内诱发肿瘤。,（二）DNA病毒,5有的DNA病毒不能直接通过DNA复制过程进行基因组复制：必须先转录出一个RNA中间体（前基因组），然后通过逆转录过程才能完成基因组复制(HBV)。6DNA病毒一般比RNA病毒大，生活周期较复杂。,腺病毒基因组,乙型肝炎

29、病毒基因组基因组长3.2kb，是带有部分单链区的环状双链 DNA分 子，两条链长度不等。长链为负链：L(-)长度固定，携带有病毒全部的编码信息。短链为正链：S(+)长度不等，约1.6kb-2.8kb。,（一）基因组的一般特点,（二）几种典型的RNA病毒,（三）RNA病毒,1.单链或双链，但以单链RNA为多见 2.所携带的遗传信息一般都在同一条链上，因此病毒RNA链有正负之分 3.许多哺乳类逆转录病毒属于单正链双体RNA，含有2个相同的()RNA，属于双倍体 4.RNA病毒变异率很高，平均每103-104个bp中有一个突变 5.RNA病毒的复制和转录常常独立于宿主细胞核 6.尽管不同RNA病毒的

30、复制方式不相同，但均需经逆转录完成其基因组的复制,（一）基因组的一般特点,丙型肝炎病毒基因组病毒呈球型颗粒，直径约50nm，有脂质包膜 基因组为单链正链RNA病毒，链长约9.5kb 整个基因组只有一个ORF，编码3011或3010个氨基酸,人类免疫缺陷病毒基因组 人类免疫缺陷病毒是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体，属于逆转录病毒由2条相同的正链RNA在5端通过氢键互相连接形成二聚体 单链RNA含9749个核苷酸，共有9个基因：3个为结构基因（gag、pol、env），6个为调控基因（tat、rev、nef、vif、vpr、vpu）,三、人类基因组,细胞核基因组 细胞质基因组（线粒体基因

31、组）,1.单一序列2.重复序列 a.串联重复序列 b.散在重复序列 3.多基因家族与假基因,（一）基因组结构特征,Introns are removed to make mRNA from an interrupted gene,mRNA,串联重复序列,重复频率可达106以上在基因组中所占比例随种属而异，约占10%-60,在人类基因组中约占20复杂度低,复性速率快,卫星DNA（satellite DNA）大小不一，成串排列 碱基序列不同于其他部份，等密度梯度离心可将其与主体DNA分开,小卫星DNA微卫星DNA,DNA指纹用于罪犯识别,DNA指纹用于亲子鉴定,3.多基因家族与假基因多基因家族（m

32、ulti gene family）由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。假基因（pseudogene）多基因家族中不产生有功能的基因产物的某些成员,用 表示。,多基因家族的特点：,多基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；有些多基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene),（二）人类基因组多态性,3.单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）4.拷贝数多态性,1.限制性片段长度多

33、态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）2.微卫星和小卫星多态性,1.限制性片段长度多态性 多态性出现在限制性核酸内切酶的酶切位点序列中，用某个内切酶水解基因组的某段序列时，在同种的不同个体之间该段序列可能被酶解成长短不等的几个DNA片段。这段序列在该种生物的群体中形成多态性。,限制性核酸内切酶片段长度多态性,3.单核苷酸多态性 单个核苷酸的变异，人群中个体差异最具代表性的DNA多态性 人类基因组中每1kb就有一个SNP位点,共约300万个,变异的4种形式 三种颠换：C A（G T）C G（G C）T A（A T）一种转换：C T（G A）转换的频率是颠换的3倍，因此转换是SNP发生的主要原因。,第四节 核酸分子标志物,基因突变、基因多态性位点、等位基因等分子生物学检验的具体内容统称为核酸分子标志物,一、核酸分子标志物的分类二、分子标志物的未来发展,一、核酸分子标志物的分类,（一）基因突变,（二）基因多态性位点,（三）等位基因（四）RNA（五）线粒体DNA（六）病原生物基因组（七）循环核酸,思考题：,原核生物基因组和真核生物基因组有什么区别？,