第五章食品微生物检验室及配置2.ppt

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1、,第一节 食品微生物检验室,一、微生物检验室的设计与建设（补充）二、微生物实验室的生物安全分级（补充）三、食品微生物检验室的基本要求四、无菌室基本要求五、食品微生物检验室技术操作要求,一、食品微生物检验室基本要求,2,微生物检验室要求高度清洁卫生，要尽可能地为其创造无菌条件。为达此目的，房屋的墙壁和地板，使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。,（一）国标规定的基本要求,（二）实验室管理的具体要求,一、以食品微生物检验室基本要求,基本要求（关键的、概括的）：GB 4789.1-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则,（一）国标规定的基本要求,一、食品微生物检验室的基本要求,（一）国标

2、规定的基本要求,（二）实验室管理的具体要求,（二）实验室管理的具体要求,1.实验室管理体系的简单介绍,2.食品微生物实验室的管理体系要求,A.食品微生物检测实验室检测活动的目的、过程和组织B.ISO 17025和实验室认可认证（CNAS/CMA）,ISO 17025：检测和校准实验室能力的通用要求CNAS-CL01 检测和校准实验室能力认可准则 来源于ISO 17025,1.实验室管理体系的简单介绍,中国合格评定国家认可委员会CNAS（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）,ISO：国际标准化组织

3、International Standard Organized,计量认证（CMA）：中华人民共和国计量法中规定：为社会提供公证数据的产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门对其计量检定、测试能力和可靠性考核合格，这种考核称为计量认证。,实验室管理依据：CNAS-CL01 检测和校准实验室能力认可准则（ISO17025检测和校准实验室能力的通用要求）,举例：学校的管理与教学or 班级管理,2.食品微生物实验室的管理体系要求,CNAS-CL01 检测和校准实验室能力认可准则,CNAS-CL01 检测和校准实验室能力认可准则,2.食品微生物实验室的管理体系要求,（1）管理要求,（2）技

4、术要求,（3）过程和结果控制要求（即质量控制与保证）,（4）检测报告要求,四方面讲解,（1）管理要求,1.目标和任务：根据国际通用标准规范、结合食品检验的实际情况，严格食品微生物检验室质量控制规范。,2.组织和结构：具有明确的法律地位,3.管理体系：严格的一整套的技术管理体系。,4.文件控制：检验工作应遵循国际或国家的制定法规、标准或检验程序。,实验室四大管理体系文件（举例）：质量手册 程序文件 作业指导书（SOP）记录表格,（2）技术要求,决定实验室检测正确性和可靠性的因素有很多，包括：人员；设施和环境条件；检测和校准方法及方法确认；设备；测量的溯源性；抽样；检测和校准物品的处置。,（2）技

5、术要求,七大要素：人、机、料、法、环、测、抽样,1.人：人员,设备种类和数量能满足检测要求：温控设备培养箱、冰箱、冰冻机、烤箱 定容设备吸管、自动分液器、微量移液器 测量设备温度计、计时器、天平、酸度计、菌落计数器 除菌和灭菌设备超净工作台、生物安全柜、高压灭菌锅 其他设备显微镜、离心机、均质机）设备安装布局要便于操作、易于维护、清洁和校准。设备要定期进行维护和性能验证，并保存相关记录。每次特种设备的操作应由受过培训的检验人员（2人）在 场，以防事故。,2.机：设备的要求,3.料：检测物料的要求,样品（1）检查、确认和登记接收到的样品有效状况。因为为微生物检验项目，对样品的储藏和运输中的温度、

6、光照或持续时间等因素较敏感。（2）实验室应有样品传递、储存、处置和识别的管理程序。样品需有可识别的管理系统和状态标示，（3）在储藏在适当的条件下，以确保样品在保存期内不变质。,25,检测中使用到的药品试剂等（1）实验室用水：满足实验室用水一级水的要求（2）培养基的管理：是微生物检验的关键试验材料。实验室必须对自配和购买的培养基的可靠性采用一定的方法进行鉴定，以确保其有效性。如自配的，必须保存配制记录。正途购买、验收合格、适当保存和有效可用。（3）其他试剂药品：应有对试剂进行检查、接收、拒收和储存的程序，确保符合相关检测的需要，正途购买、验收合格、适当保存和有效可用。,4.法：检测方法的要求,总

7、则：实验室应使用适合的方法和程序进行所有检测，包括被检测物品的抽样、处理、运输、存储和准备。,（1）方法的选择 实验室应采用满足客户需求并适用于所进行的检测的方法，包括抽样的方法。应优先使用以国际、区域或国家标准发布的方法。实验室应确保使用标准的最新有效版本，除非该版本不适宜或不可能使用。必要时，应采用附加细则对标准加以补充，以确保应用的一致性。,（2）方法的证实 实验室采用标准方法时要进行证实实验，进行一定的实践验证，确保自身实验室具备完全可开展的条件后使用。,（3）自制检测方法应由实验室有资格能力的人进行；引用非标方法要进行标注记录。,具备满足检验要求的检测室、功能区和辅助设施（大门、走廊

8、、管理区、样品室、洗手间、储存室、文档室等）具备可控制工作环境的设施：应具备相应的设施和保证设施的有效状态。如：空调、中央空调、空气过滤系统、排气系统设施、照明等。具备监控环境条件的的测量仪器并定期进行计量校准，如温度计、湿度计、压力表等。制定科学合理的环境检测程序（使用诸如空气采样器、沉降平板接触盘等）。具备安全设施：具备检测人员的个人安全防护装备，如防护服、手套、口罩等，具备安全事故处理设施，如洗眼器、紧急冲淋装置、药箱、灭火器材和生物安全污染处理设施等。污染废物的处理。实验室应制定方案来减少废物污染检测环境和设施的可能性。需具备处理废物的设备设施，如污染废物应使用灭菌锅在121持续灭菌至

9、少45 min.,5.环：环境和设施的要求,6.测：测量溯源性要求,总则：用于检测对检测、抽样结果的准确性或有效性有显著影响的所有设备，包括辅助测量设备（例如用于测量环境条件的设备），在投入使用前应进行检定校准。实验室应制定设备校准的计划和程序。,器皿：如容量瓶、移液管等仪器设备：如 pH计、培养箱、天平等标准物质和标准培养物：微生物检测实验室可使用来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。,Key words：检定、校准、计量院、标准物质和标准菌株、菌种保藏中心,7.抽样,食品微生物检测常见抽样方案：见课本第四章,2.食品微生物实验室的管理体

10、系要求,（1）管理要求,（2）技术要求,（3）过程和结果控制要求（即质量控制与保证）,（4）检测报告要求,四方面讲解,（3）过程和结果控制要求（即质量控制和保证）,实验室应有质量控制程序以监控检测的有效性。,这种监控应有计划并加以评审，可包括（但不限于）下列内容：a)定期使用有证标准物质（参考物质）进行监控和/或使用次级标准物质（参考物质）开展内部质量控制；b)参加实验室间的比对或能力验证计划；c)使用相同或不同方法进行重复检测；d)对存留物品进行再检测；e)分析一个物品不同特性结果的相关性。,举例：测量审核和能力验证,（4）检测报告要求,实验室应准确、清晰、明确和客观地报告每一项检测、校准，

11、或一系列的检测的结果，并符合检测方法中规定的要求。,例4789.2：检测结果符合检测方法标准中的结果与报告的要求,33,34,第一节 食品微生物检验室,一、微生物检验室的设计与建设（补充）二、微生物实验室的生物安全分级（补充）三、食品微生物检验室的基本要求四、无菌室基本要求五、食品微生物检验室技术操作要求,二 无菌室基本要求,36,1、新建无菌室的处理及设计要求,（1）无菌室应设在较洁净的环境中，无污染源;（2）一般无菌室面积5-6m2，不要大于10m2，室内六面 应光滑平整，耐腐蚀、易清洗，室内门窗结构应密和，并尽量减少活动窗口面积，门为推拉门，便于用臂肘及 脚开关;（3）隔去1/4左右作缓

12、冲间，室高2-2.5m，做准备工作;（4）无菌室先用3%的煤酚皂擦洗工作台面及地面，再用甲醛加高锰酸钾熏蒸空气。日后要定期熏蒸；（5）每次使用无菌室前用紫外灯照射3060分钟定期检查杀菌效果；每两星期用酒精棉球擦拭紫外线灯管（6）新建的无菌室启用前或细菌总数检测不合格(净化级别为100级，平均菌落数1个不小于5m粒子数3.5个/L),2、无菌室的使用与管理,无菌室应保持清洁，摆放最必须的检验用具；检验用具及桌椅等位置保持固定，不随便移动；每2-3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌椅、地面，然后用甲醛加热或喷雾灭菌，最后紫外灯灭菌30min；定期检查室内空气无菌状况，细菌数应控制在10个

13、以下；无菌室杀菌前，应将所有物品置于操作之部位（待检物例外），然后打开紫外灯杀菌30min,时间一到，关闭紫外灯。般实验要求进入前洗手，自然干燥或烘干，用臀肘推开级冲间门，尽快穿上无菌鞋，关缓冲间门，打开灭菌衣物，穿好无菌衣，戴上无菌口罩及帽子，女工作人员一定要把头发放入帽内；,37,操作应严格按照无菌操作规定进行，操作中少说话，不喧哗，以保持环境的无菌状态。（8）无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上最多只允许摆放以下物品：,38,3、器材及场所的灭菌消毒,不同的对象处理方法不同、高压蒸汽灭菌（121）,工作服、口罩，培养基、移液管等。、火焰灭菌：接种针、接种环。、高温干燥灭

14、菌：各种玻璃器皿、注射器，干燥箱160，2h;、一般消毒：无菌室内的凳子、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法进行灭菌，用其他方法进行消毒处理，用2%石炭酸或苏尔水溶液擦拭消毒；、空气的消毒：紫外灯照射。,4、准备工作要领,先进行无菌室空间的消毒，开启紫外灯30-60min；检验用的有关器材，检验前必须消毒灭菌；操作人员必须将手清洗消毒，穿戴好无菌衣帽鞋，采取必要的防护措施。进入无菌室后再一次消毒手部，然后进行检验操作。,40,5、操作过程注意事项,动作要轻，不要太快，玻璃器皿轻拿轻放 操作应在近火焰区操作 接种针及接种环使用前后均需灼烧 使用吸管时切勿用嘴直接吸、吹吸管，而必须用洗耳

15、球操作，不能向含有感染性的溶液中吹入气体。观察平板时不要开盖，如欲蘸取菌落检查时，必须靠近火焰区操作，平皿盖也不能大开，而是上下盖适当开缝。使用可疑致病菌涂片染色时，应使用夹子夹持玻片，切勿用手直接拿玻片，以免造成污染，用过的玻片也应置于消毒液中浸泡。然后再消毒。；工作结束，收拾好器具，用消毒水擦拭工作台。,41,第一节 食品微生物检验室,一、微生物检验室的设计与建设二、微生物实验室的生物安全分级三、食品微生物检验室的基本要求四、无菌室基本要求五、食品微生物检验室技术操作要求,1、无菌操作要求,微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作，防止杂菌污染。为此，在实验过程中，每个人要严格做

16、到以下几点：、要穿干净的白色工作服,带工作帽：微生物学工作者在进行实验操作时应穿上白色工作服，离开时脱去，并经常洗涤以保持清洁。、操作时要预防空气对流：在进行微生物实验操作时，要关闭门窗，以防空气对流。、接种时不要走动和讲话：接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅而导致杂菌污染。、进行接种所用的平皿、培养基等含菌器具要灭菌消毒后清洗，打开包装后的器具不能放置后直接使用。,43,、从包装中取出吸管，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种试管或平皿时，不得触及试管或平皿边。、接种样品转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。、接种环和

17、接种针在接种前后均需火焰灼烧全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。、吸管吸取菌液或样品时，不得用口吸。、含培养物的器皿要杀菌后清洗：在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管等之前，应先煮沸10min或进行加压蒸汽灭菌。,44,.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。.无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。.无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30

18、min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。.在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。,45,2、无菌室使用要求,46,3、消毒灭菌要求,（1）干热和湿热高压蒸汽灭菌,、灭菌前准备、装放干热灭菌器、设备检查、干热灭菌、高压湿热灭菌步骤,微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。,（四）有毒有害菌污染物处理要求,微生物检验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得

19、带出实验室。,（五）培养基制备的要求 P14,1.经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并隼中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。2.经微生物污染的培养物，必须经12130 min高压灭菌。3.染菌后的吸管，使用后放入5煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经12130 min高压灭菌。4.涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗涤。做凝隼试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。5.打碎的培养物，立即用5煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。6、污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。,参考文件,GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则GB 27405-2008实验室质量控制规范 食品微生物检测GB 50364-2004 生物安全实验室建筑技术规范GB 19489-2004 生物安全通用要求GB 15981 消毒与灭菌效果的评价方法与标准CNAS-CL01 检测和校准实验室能力认可准则CNAS-CL05：实验室生物安全认可准则ISO/IEC 17025 检测和校准实验室能力的通用要求,