第五章 基因药物专题.ppt.ppt

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1、生物制药技术,蔡谨，13857136417（676417）C浙江大学玉泉校区教十5212室,Chapter 5 Gene Medicine(gene therapy),1.概念基因：染色体上的DNA片段，是遗传信息结构和功能 的基本单位。基因 决定 生老病死 控制 高矮胖瘦 影响 喜怒哀乐基因组：某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。,一.概述,基因与疾病基因与人类的疾病密切相关：遗传病是由于基因先天缺陷所致;肿瘤的发生涉及多种基因改变,包括癌基因激活或抑癌基因失活;高血压,糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变;由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关,存在易感人群和耐受人群.,基因药物：将

2、具有治疗作用的基因重组进真核表达载体，直接转移到人体细胞，表达出具有治疗作用的蛋白质和多肽，从而达到治疗作用的新方法。The application of genetic principles in the treatment of human diseaseBy introduction of genetic material into target cells in order to counteract the effect of a disease gene or introduce a new function,“You may never have to purify a prot

3、ein,or manufacture a drug,you just have to make the vector and get into the patient.Why bother marketing it?You can just let the cell do it.”Prof.Jum Wilsome,美国基因治疗中心主任,基因治疗的必要条件,Understanding of the disease process Structure/function of gene to be introduced Efficient delivery of gene control of ge

4、ne expression Prevention/control of immune responsesAnimal model and assessment of function Clinical trial,研究基因治疗的三个基本步骤寻找适当的靶细胞导入目的基因基因表达,分类,生殖细胞基因治疗（germline gene therapy）生殖细胞或早期胚胎细胞体细胞基因治疗(somatic-cell gene therapy)体细胞,体细胞基因治疗始终需要考虑的问题基因转移的效率治疗的特异性基因表达的持久性及其调节治疗的毒副作用 什么疾病什么基因什么载体什么靶器官和靶细胞什么基因导入方法

5、,二、基因治疗和传统的基因工程的区别 二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的“目的基因”。基因工程：目的基因载体导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞体外表达所需要的蛋白经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品,最终是制造出一种蛋白类的药物。,基因治疗目的基因载体导入人体，目的基因在人体内的细胞中制造所需要的蛋白达到治病的目的。基因治疗在技术上一旦成功,其优势：制品为基因及其载体，非基因表达蛋白 产物,不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺生产成本远远低于基因工程产品从理论上讲,凡能治病的基因，都有可能开发 成为“药物”半衰期,但基因治疗难度高，技术要求极为苛刻。例如，针对各种疾病，必须具有能够达

6、到治病目的的基因。在此基础上，还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统，这种系统要求高效，而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入人体后，必须能够控制它的表达。,因此，基因治疗是生物高技术的高度集成，是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。,三、基因治疗的主要策略Gene replacementGene augmentation therapy(GAT)Gene correction(Chimeraplasty)Targeted killing of specific cellsTargeted inhibition of gene expression(G

7、ene ablation),Gene replacement:Deficient gene corrected by replacing the mutated allele with an intact allele;used for the treatment of autosomal dominant disorders.The strategies are as follows:a)kockout mutation by single crossing-over(insertional inactivation)b)gene replacement by double(reciproc

8、al)crossing-overc)target gene inhibition in dominant negative genetic disorders;usually mutated proteins which interact with normal cellular proteins to create altered properties;mutational inactivation of the one mutated copy will alleviate this mutant phenotype;the mutation can be carried out by i

9、nsertional inactivation,or antisense technology.,Gene Augmentation Therapy(GAT)For diseases caused by loss of gene function more copies of normal gene raise levels of gene product restore normal phenotype Apply to:monogenic recessive diseases cystic fibrosis,haemophilia,muscular dystrophy,Gene Corre

10、ction-Chimeraplasty,tumour cell,tk,thymidine kinasegene,viral vector,ganciclovir,ganciclovir phosphate,Targeted Killing Genetic Pro-drug Activation Therapy,Targeted inhibition of gene expression Ribozymes-can cleave(or repair)mRNA Triple helix oligonucleotides-block gene transcription Antisense olig

11、os-block mRNA translation,All gene therapy strategies dependon getting the gene or genetic material into the target cells!,治疗方式矫正性基因治疗 基因置换（gene replacement）基因矫正(gene correction)基因增强(gene augmentation)调控性基因治疗 调控基因的表达来达到改善疾病的目的（1）反义技术 A）反义基因到载体，耙细胞到反义RNA，封闭 mRNA的翻译 B)合成反义寡聚脱氧核苷酸，化学修饰导入体内，胞吞与DNA结合形成核苷

12、酸三聚体，与转录因子结合，转录不能启动；或与mRNA结合形成RNA-DNA杂链，影响基因的表达。,C）核酶 具有催化作用的RNA分子，能催化切割降解异常表达基因的RNA分子，已经设计出特殊的核酶。（2）通过其他基因的代偿作用弥补缺陷基因的功能。,四.基因转移体系,若干相关术语：Transfection 转染：过去：将病毒DNA或RNA 转入细胞。现在：将外源DNA转入动物细胞。DNA Transfer 转移：基因导入或转移广义的概念。Transduction 转导：噬菌体介导的细菌之间的基 因 转移。Transformation 转化：将裸DNA或质粒导入原核 和真核细胞。,转移途径,1）ex

13、 vivo 法，体外途径。体外基因导入人体细胞，再将细胞植入人体。经典，安全，效果较易控制，对基因转移效率 要 求不高，但步骤多，复杂，难度大。2)in vivo法，体内途径。将含治疗基因的重组载体直接植入体内。操作简单，容易推广，但对基因转移技术要求高。,a,a,a,a,a,a,Ex-vivo,In-vivotopical delivery,In-vivosystemic delivery,Examples:-bone marrow-liver cells-skin cells,Examples:-brain-muscle-eye-joints-tumors,Examples:-Intrav

14、enous-intra-arterial-intra-peritoneal,THREE classes of anatomical gene delivery,基因治疗过程中的基因转移方法Viral vectorsNon-viral vectorsPhysical methods目前最有效的是病毒载体，但存在插入大小有限、免疫原性强和生产难等局限,1、病毒载体类型反转录病毒（RV）载体retrovirus腺病毒（AV）载体adenovirus 腺相关病毒（AAV）载体Adeno-associated virus单纯疱疹病毒（HSV）载体herpes simplex virus 慢病毒（lent

15、ivirus)载体等,对载体的基本要求：特异并有效的基因转移特异、高效、持续性表达，具有可控性免疫原性低易于生产,载体特征：reproducibility stable propagated purified to high titers mediated targeted delivery,基因治疗病毒载体比较 RV AV AAV HSV LV基因组成 ssRNA dsDNA ssDNA dsDNA dsRNA基因组长度 10kb 36kb 5kb 152kb 10kb装载容量 8kb 8kb 4.5kb 30kb 9kb病毒滴度 107 1011 108 108 108感染细胞谱 窄 宽

16、宽 窄 宽感染能力 中 很强 强 强 中整合能力 有 无 有 无 强毒性作用 遗传毒 细胞毒 遗传毒 细胞毒 遗传毒免疫原性 弱 中等 弱 强 弱,病毒型载体,逆转录病毒,腺病毒,疱疹病毒,腺相关病毒,慢病毒,优点:安全，对人体低病原性针对增殖的细胞长期稳定表达外源基因插入能力适中。缺点:导入率低随机整合到宿主细胞，有插入性基因突变或癌变的危险无导向性。,优点:高效导入、高滴度非增殖细胞也能导入，对遗传、代谢病有利基因插入能力强（30kb）宿主广泛缺点:有严重的免疫反应。无导向性,优点:无细胞毒性，无免疫反应 转导稳定，长期表达具有在特定位点整合的潜力，导入基因后可特殊表达个体小，可广泛分布。

17、缺点:可做到高滴度,但包装困难有随机整合的可能基因插入量有限（5kb）,优点:有嗜神经性，可用于神经系统疾病有环状分子形式的潜伏状态基因插入容量大。缺点:细胞毒性和免疫原性不 定潜伏期HSV-1可能回复突变为野生型,导致脑炎或死亡,优点:能转导神经细胞中等插入量。缺点:随机整合可能回复突变为野生型。,retrovirus,adenovirus,HSV,AAV,lentivirus,反转录病毒载体基因转移系统辅助细胞:将含有病毒结构基因但缺失了顺式包装信号的缺陷型反转录病毒导入哺乳动物细胞（2，PA317，CRIP）。可产生病毒包装蛋白但不产生病毒颗粒；反转录病毒载体:以外源目的基因替换病毒结构

18、基因,含病毒包装信号辅助细胞提供载体包装蛋白，使后者产生含外源目的基因的病毒颗粒,缺陷型的反转录病毒颗粒的RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整合到宿主细胞的染色体上，可稳定表达外源基因。反转录病毒只能感染处于增殖期的细胞。,反转录病毒安全性问题病毒感染的可能性病毒在靶细胞基因组整合可导致:破坏细胞正常生长必需的抑癌基因 LTR激活原癌基因 染色体重排激活原癌基因,腺相关病毒（AAV）载体：4.7kb单链DNA，结构为 ITR-rep-cap-ITR，病毒基因组简单，易于消除，可降低细胞毒性和T-淋巴细胞反应的危险性；病毒DNA可在人19号染色体上进行位点特异性整合，需要辅助因子出现才复制；其Re

19、p蛋白可能介导这种定向整合宿主范围宽，易感染造血干细胞，能潜伏感染非分裂期细胞；在动物模型中表达可持续半年以上。但AAV载体接纳的外源DNA小于4.5kb，载体整合效率较低，制备困难,HSV病毒,双链DNA,包括:HSV-1,2,VZV,EB,CMV.主要以HSV-1型为主.HSV载体含包装信号,复制位点等顺序结构,HSV病毒启动子,目的基因表达框架.由辅助病毒共转染辅助细胞M64A,制备重组病毒.辅助病毒的改造:IE3 温度敏感突变型;缺失突变型:IE3缺失;应用:感染心肌细胞,神经元,神经胶质细胞.VEGF-血管形成;脑肿瘤;帕金森病,Lentivirus（慢病毒载体）优点:感染非分裂细胞

20、，有RV优势结构:LTR-gag-pol-env-LTR TAR tat,rev,tev应用:宿主广泛;艾滋病基因治疗问题:安全性,2、非病毒及物理方法脂质体介导法磷酸钙转染法机械法（显微注射、基因枪等）DEAE-葡聚糖和polybrene(聚凝胺)转染法电穿孔法超声波辅助法纳米材料等,中性脂质体 由脂类形成的可高效包装DNA的人造单层膜，其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，细胞的内吞作用使其进入细胞，操作简单，转染效率可高达50%，可用于体内试验，但目的基因表达不稳定,阳离子脂质体：阳离子脂质体在水中可形成大小约100-400nm单层脂质体。其带正电，带负电的DNA可自动结合到带正电

21、的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，与细胞膜作用使DNA进入细胞。在该系统体内基因导入效率低，且无靶向性。在体内应用，除肿瘤瘤内注射外，其前景仍存在问题。,磷酸钙转染法：将氯化钙、目的DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成含有DNA的极小的不溶性磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜，通过胞饮进入受体细胞的细胞质，转染过程简单有效，适用于贴壁、非贴壁细胞，转染效率可达20%左右，但目的基因表达不稳定,机械法如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将外源DNA直接转入受体细胞核。基因枪使用高压DNA分子导入细胞。,基因枪工作原理,显微注射,裸DN

22、A基因转移和治疗 进展展望裸DNA肌肉注射，活体转移非病毒基因转移越来越重要电击促进质粒DNA进入肌肉皮肤未来几年遗传病临床试验将首选血友病血管内导入质粒DNA，肝细胞基因转移Duchenne 肌营养不良，关节炎等尾静脉导入pDNA，简单有效，转染大、啮齿类的尾静脉注射作为快速检测表小鼠肝细胞 达状况和基因治疗方法广泛应用pDNA表达载体可高水平持续表达血管内裸DNA导入为细胞有效涉入pDNARNAi将在基因治疗领域中成为重要手裸DNA导入法已经在临床研究（PAOD，段外周动脉闭锁症）SiRNA可通过血管内基因转移法有效导入Knockout 小鼠,基因治疗载体的发展趋势综合病毒载体与非病毒载体

23、的优势,构建杂种病毒载体其需要达到的境界：靶向性进入特异细胞表达持久、可控、安全、高效商业化定做（tailormade)依据特异的治疗依据不同个体,五.细胞的选择,体外基因治疗靶细胞的基本要求：1.应来自受治者。2.可以或容易从体内获得。3.容易在体外培养和大量扩增。4.易被重组基因转染。5.输回体内能确保携带的目的基因稳定表达。6.能在体内存活一段时间。7.不影响临近组织的正常生理功能。,基因治疗常用细胞,1.骨髓细胞 造血干细胞。优点：源自造血干细胞的细胞遍布全身，几乎存在于所 有器官组织，可治疗一些与其不直接相关的疾病。有些遗传病直接与其有关。缺点：改造的细胞很少。治疗基因在细胞中表达的

24、时间太短。干细胞分化导致基因失活。有些遗传病与造血干细 胞 完全无关,特点：可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪或肌肉细胞、神经胶质细胞等，也可分化为造血干细胞和基质细胞。可利用定向分化的生长因子转入干细胞，促进其定向分化。,骨髓间质细胞（MSCs）,生骨细胞,2.非造血干细胞,成肌细胞 可分化为心肌、骨骼肌。,肝脏细胞,以肝脏细胞为靶细胞可治疗代谢相关疾病和肝癌、慢性病毒性肝炎等,神经细胞,以神经细胞为靶细胞可疗神经系统相关疾病如帕金森病和脑外伤等,神经干细胞的分化,可治疗遗传性皮肤病,角质形成细胞,成纤维细胞,上皮细胞,内皮细胞,3.人体淋巴细胞,人体的淋巴干细胞在体内 寿命可长达几年。基因治

25、 疗用的淋巴细胞一般为T 细胞（B细胞寿命太短）。,4.肿瘤细胞。,六.基因治疗的耙向问题,安全性和有效性：基因在体内表达的空间，时间的精确定位，表达水平的调控。,目的基因表达空间的定位,靶向载体（Targeting vectors）靶向转录(Transcriptional Targeting)靶向载体（Targeting vectors）1)受体介导的基因转移 2）靶向反转录病毒载体,靶向转录 将外源基因置于具有组织特异性的启动子的下游，只有特定组织细胞中的转录因子才能与这些启动子作用并激活转录，从而实现目的基因的选择性表达。,目的基因表达时序的调控,采用可被内源或外源因素诱导活化的启动子来

26、指导目的基因的表达；早期生长因子启动子(early growth factor,egr-1)能被辐射诱导激活，并进行不连续的表达，通过照射的精确定位，可使启动子控制的目的基因在空间和时序上定位表达。利用基因开关来激活或关闭目的基因表达,目的基因表达水平的调控,多数组织特异性启动子为组成型启动子，转录活性低；VP16为基础的转录激活系统来放大组织特异型启动子的作用,七.基因药物的靶器官,1.骨骼肌 含量丰富；“永生性”细胞，没有明显的细胞更替；细胞长体积大，细胞膜面积大；多核细胞（300多个细胞核），有利于的基因核转移 专施收缩的“非生命”器官，相对安全 含溶酶体少，DNA降解少，基因表达时间长

27、 血流丰富，基因产物可释放入血液中，有远程效果,2.呼吸道和肺 雾化基因3.皮肤 4.其他途径,八 基因治疗的治疗案例,一.单基因缺乏症世界上第一例基因治疗临床实验于1990年9月展开，患者为两个患有ADA缺乏症的儿童。ADA缺乏症：是一种由于腺苷脱氨酶（ADA）缺陷而引起的严重的联合免疫缺陷症。,中国首例基因治疗于1991年8月展开，患者为两例患血友病乙的儿童。血友病乙：是一种由于遗传性IX因子缺乏而引起的凝血障碍性疾病。,二、肿瘤的基因治疗,目前，进入临床试验的基因疗法有70%是针对癌症的，虽然大多数尚未被肯定疗效，但代表了癌症治疗的方向。恶性肿瘤基因治疗方案中，所用的治疗基因大致可归为三

28、类：细胞因子类；杀伤性基因类，以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶（HSV/TK）为代表；以p53为代表的抑癌基因及反义癌基因类。,2003年10月16日，全世界第一个基因治疗药物p53腺病毒注射液由中国国家药品监督管理局颁发新药证书！,常见癌症治疗方案外源性基因替补疗法 输注外源性抑癌基因p53可抑制或杀灭癌细胞。抗原基因导入疗法 将组织相容复合体基因转移给肿瘤细胞，在肿瘤细胞表面大量表达，与肿瘤抗原结合形成复合抗原，从而暴露出“靶点”被免疫细胞识别和消灭,反义基因疗法 以癌基因DNA的有义链为模板合成出反义链，将其转入肿瘤细胞内，形成的双链核酸阻断癌基因表达和癌细胞增殖。自杀基因疗法 将自杀基因（又

29、称前药转换酶基因如胸苷激酶tk基因和胞嘧啶脱氨酶CD基因等）,导入癌细胞内，使癌细胞死亡。细胞因子基因导入疗法 将白细胞介素II、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子基因导入肿瘤细胞内，所产生的细胞因子可引起癌细胞死亡；也可将这些细胞因子基因导入肿瘤组织中淋巴细胞内，增强这些细胞的抗癌作用。,目前癌症基因治疗的研究大多是在观察毒副反应为主的期临床试验，极少数进入/期临床试验，结果有待进一步观察。目前的临床研究进程很慢，这与癌症复杂的发病机制和有效载体的研发有关，虽然动物实验的结果不断涌现，但并不能完全代表人类，只有临床试验具有决定性的作用。就目前的研究成果来看，基因治疗可能会在手术、放疗和化疗以外，

30、成为一种新的肿瘤治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重要的组成部分。,三 病毒性肝炎的基因治疗 病毒性肝炎基因治疗研究虽然取得了一系列的进展，但是，由于病毒性肝炎的发病机制还没有完全了解清楚，目前基因治疗在病毒性肝炎治疗中的应用远未达到最高水平。病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治疗技术本身发展的速度和状态，另一方面也取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入程度。,病毒性肝炎基因治疗最近部分工作Xu R et al”Molecular therapeutics of HBV”Curr Gene Ther.

31、2003 Aug;3(4):341-55.病毒学杂志.2003 Mar;17(1):81-4.Ding CL et al“Expression of HBcAg in eukaryotic cells by retroviral vector mediated gene transfer”中华实验和临床病毒学，2003 Mar;17(1):81-4.Klein C et al“Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA”Gastroenterology.2003 Ju

32、l;125(1):9-18 Han JQ et al“Approach to transforming hepatitis B virus as a gene therapeutic vector”中华肝脏病杂志 2003,Jun;11(6):344-6.,四.AIDS的基因治疗方案将抑制HIV复制的基因转入T淋巴细胞后能表现出对HIV复制的明显的抑制作用。若将其转染造血 干/祖细胞，则能在体内分化为对HIV有抗性的巨噬细胞、T细胞等，从而获得长期治疗AIDS的效果。,五 SARS 基因治疗反义技术？在“反义”技术领域潜心耕耘了23载的AVI公司一直不为外界所知，直到非典出现，该公司一鸣惊人。

33、事实上，AVI公司只花了几天时间，就把对付田鼠冠状病毒和企鹅西尼罗河病毒的“反义”技术“改造”成了对付非典病毒的武器。是否成功有待证明 但是，一些专家对AVI公司成功对付非典的可能性表示怀疑。纽约阿尔伯特爱因斯坦医学院的赛斯滕博士说，他要看更多的数据。这位被称为“反义技术之父”的博士还强调，他的领域充满了失败，“我们的了解不多，（这一技术）实在太复杂”。“反义”技术之复杂在于，一是它除了能切断有害基因及其编码的蛋白质之间的信号传播，也会影响与疾病没有关系的其它基因和蛋白质；二是它有可能最终被证实不能切断信号传播。,九 基因治疗成功的基本条件,1.深入了解变异性。2.要充分察知细胞内基因的调节。

34、3.要选择好受体细胞。4.要选择稳定有效的载体。5.受转染的细胞要合格。（即要求其具有 生长优势，长期存活和稳定而又高水 平的表达）,现有基因治疗的潜在危险,1.病毒通常能感染多种细胞，若作为载 体，可能会改变非目标细胞。2.新基因插入DNA的位置可能出现错误，导致癌症和其他损伤的产生。3.转化基因可能“过表达”，产生过多的缺 失蛋白，导致机体损害。4.病毒载体产生炎症或免疫响应。5.患者可能将病毒传播给其他个体或转播 到环境中。,1.安全、靶向、高效表达的基因 导入系统。2.对导入基因的表达调控。3.致病基因及其调控机制的发现（已知的能有效治病的基因为数 太少）。,基因治疗的发展方向,十、我

35、国基因治疗成就和存在问题（一）成就：1991年复旦大学进行了国际首例血友病B基因治疗临床实验2000年四川大学首先提出利用异种同源分子作肿瘤基因治疗的策略2002年上海市肿瘤研究所设计的非病毒基因导入系统获得美国专利 2003年，世界上第一个基因治疗药物在中国诞生 我国已有14个基因治疗方案进入临床试验,（二）存在问题：大多重复国外同类实验；缺乏创新性，各自为政,规模小,资金投入有限,缺乏中心的辐射作用；一哄而上,一哄而下,缺乏基因治疗正确认识.缺乏孵化和转化机制,更缺乏风险基金；基因治疗研究和相关研究如基因组学,病毒学,免疫学,转基因动物,临床医学的结合不够；初级 人才流失,高级人才匮乏；过于强调商业价值,忽视科学价值和样板作用,P53 的基因治疗高纯度质粒的生产反义寡核苷酸药物研究进展,